[发明专利]具有串联转录单位的重组流感病毒载体

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2004年11月19日提交的美国申请序号60/629,665的权益，所述申请的公开内容在此引入作为参考。

政府权利声明

本发明是在美国政府资助下完成的(美国公共卫生服务部国立变态反应和感染性疾病研究所(National Institute of Allergy and InfectiousDiseases Public Health Service)资助号AI047446)。美国政府在本发明中可享有一定的权利。

发明背景

流感季节性流行和大流行持续夺走人类生命，并影响全球经济。单在美国，流感每年引致估计50,000例死亡(Thompson等，2003)，而全球大流行可导致数百万例流感相关死亡。一个经典事例就是所谓的‘西班牙流感’，其于1918-1919年在全世界夺走了估计4000-5000万人的生命(Potter，1998)。流感病毒施加的威胁由于近期禽流感病毒传入人群中而被进一步提升。长期以来一直认为禽流感病毒不会直接传播到人类并引起致死结果。但是，这种观念在1997年被改变，当时18名香港居民被H5N1亚型的全禽流感病毒感染，导致6人死亡(Subbarao等，1998；Claas等，1998)。在之后的几年当中，报告了其它几例直接禽传人病例(Peiris等，2004；Fouchier等，2004；Koopsman等，2004)，包括在几个亚洲国家正在发生的高致病性H5N1流感病毒的爆发，至2005年1月26日为止夺走了54名受感染个体中的41条生命(WHO，2004)。人H5N1病毒感染数量的逐渐增加连同高死亡率以及可能的人传人传播一起，使得必须开发针对这些病毒的疫苗。

在美国，两种流感疫苗获颁人用许可：一种灭活疫苗和一种减毒活疫苗病毒。流感病毒疫苗的生产依赖于重配(Gerdil，2003)，其需要用提供血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)节段的循环野生株和A/PR/8/34(PR8)病毒(在鸡胚(egg)中提供高生长特性的减毒人病毒)或提供减毒表型的减毒活病毒共感染细胞。选择期望的“6+2”重配体(即在PR8或减毒活病毒遗传背景中含循环野生株的HA和NA基因节段的那些毒株)耗时且麻烦。而且，需要重配和选择以及某些重配体病毒不能培养至高滴度导致疫苗生产延迟。

对于甲型和乙型流感病毒，高效反向遗传系统目前所处状态允许由克隆的cDNA产生这些病毒(Neumann等，1999；Hoffmann等，2002；Fodor等，1999；Hoffmann等，2000)。在一个系统(Neumann等，1999)中，8种质粒编码处于RNA聚合酶I(PolI)启动子和终止子序列控制之下的8个流感病毒RNA节段，将这8种质粒连同4种RNA聚合酶II(PolII)驱动的、用于表达3种病毒聚合酶亚单位和核蛋白NP的质粒一起转染入真核细胞中；这4种蛋白是启动病毒复制和转录所必需的。也已开发出替代系统(Hoffmann等，2000)，其依赖于8种质粒，在这8种质粒中，病毒cDNA在一个位点侧接RNA聚合酶I启动子，在另一个位点侧接RNA聚合酶II启动子，该系统允许由同一模板获得vRNA和mRNA。这些系统允许对6+2重配体进行工程化，而不需要重配和筛选步骤。

数量有限的哺乳动物细胞系可用于生产流感病毒疫苗。它们包括Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)(Brands等，1999；Palache等，1999；Halperin等，2002)和非洲绿猴肾细胞(Vero)(Kistner等，1998；Kistner等，1999a；Kistner等，1999b；Bruhl等，2000)。这些细胞系不能被高效转染，有时限制了其在反向遗传系统中用于流感病毒疫苗生产的用途；但是，在Vero细胞中生产流感病毒已得到证实(Fodor等，1999；Nicolson等，2005)。

因此，需要一种制备流感病毒的改良方法。

发明概述