[发明专利]具有改善的底物接受性的R-羟腈裂解酶及其用途

权利要求书

1.具有改善的底物接受性、增加的活性以及增加的选择性的R-羟腈裂解酶，其特征在于：

在来自Rosaceae科的R-羟腈裂解酶的氨基酸序列中存在任何下述替换：

a)对应于成熟PaHNL5蛋白的第360位的氨基酸残基被另一种无极性氨基酸或中性氨基酸替换，和/或

b)对应于成熟PaHNL5蛋白的第225位的氨基酸残基被另一种极性氨基酸替换，

如果合适的话，还可以替换活性中心中或导向将被替换的活性中心的疏水通道中的大约1至20个额外的残基。

2.如权利要求1所述的R-羟腈裂解酶，其特征在于：所述替换在来自Prunus amygdalus、Prunus serotina、Prunus laurocerasus、Prunus lyonii、Prunus armeniaca、Prunus persica、Prunus domestica、Malus communis的R-羟腈裂解酶或重组R-羟腈裂解酶中进行。

3.如权利要求1所述的R-羟腈裂解酶，其特征在于：将被修饰的R-羟腈裂解酶是完整序列的形式，或者是通过对开头的一个或多个氨基酸进行替换、通过随机插入或缺失从而被修饰的形式，或者通过缺失开头的一个或多个氨基酸而被截短的序列的形式，或通过加入其它氨基酸或通过融合而延伸的序列的形式。

4.如权利要求1所述的R-羟腈裂解酶，其特征在于：在突变之前，天然的或植物性的信号序列被交换为来自Saccharomyces cerevisiae的alpha交配因子、Saccharomyces cerevisiae转化酶、Pichia杀手毒素信号序列、α-淀粉酶、Pichia pastoris酸性磷酸酶、Phaseolus vulgaris凝集素的信号序列；来自Aspergillus niger的葡糖淀粉酶信号序列、来自Aspergillus niger的葡糖氧化酶信号序列、来自Pichia pastoris的Sec10信号序列、来自Kluyveromyces lactis的杀手毒素的28kD亚基的信号序列、BSA信号序列或其重组信号序列，或具有点突变的上述信号序列之一。

5.如权利要求1所述的R-羟腈裂解酶，其特征在于：制备通过定点诱变以及随后在下述微生物中的异源表达或分泌性表达来进行，所述微生物来自Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae或Escherichia coli、Bacillussubtilis、Pseudomonas fluorescens、Kluyveromyces lactis、Aspergillusniger、Penicillium chrysogenum、Pichia methanolica、Pichia polymorpha、Hansenula polymorpha、Pichia anomala或Schizosaccharomyces pombe的组。

6.如权利要求1所述的R-羟腈裂解酶，其特征在于：对应于成熟PaHNL5蛋白的第360位的氨基酸残基被来自异亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸的组的无极性氨基酸或被来自甘氨酸或色氨酸的中性氨基酸替换。

7.如权利要求1所述的R-羟腈裂解酶，其特征在于：对应于成熟PaHNL5蛋白的第225位的氨基酸残基被来自丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或天冬氨酸的组的极性氨基酸替换。

8.如权利要求1-7中任意一项所述的R-羟腈裂解酶用于制备对映异构纯的氰醇的用途。

9.用于制备对映异构纯的氰醇的方法，其特征在于，在有机、水性或两相系统中或在乳液中或在没有稀释剂的情况下，在-10℃至+5℃的温度以及1.8至7的pH下，在存在氰化基团供体的情况下，用如权利要求1-7中任意一项所述的R-羟腈裂解酶对脂肪族、芳香族或杂芳香族醛或酮进行转化。