[发明专利]具有改善的底物接受性的R-羟腈裂解酶及其用途

说明书

生物催化方法对于化学工业已非常重要。在生物催化剂的协助下进行化学反应在这方面令人感兴趣，尤其是在可能利用到酶的在化学反应中优先转化或优先形成具有手性或前手性组分的两种对映异构体之一的性质的领域，而这种性质是常见的性质。

用于利用酶的这些有利性质的重要前提是：它们能以工业需要的量被获得、具有足够的高反应活性、以及在工业工艺的实际条件下的稳定性。  特别令人感兴趣的一类手性化学物质是氰醇。氰醇对于例如合成用于获得生物活性物质(例如活性药物成分、维生素或拟除虫菊酯类化合物)的α-羟基酸、α-羟基酮、β-氨基醇来说是重要的。

这些氰醇是通过将氢氰酸加成到酮或醛的羰基上来制备的。

已经可以实现对例如(S)-氰醇的手性化合物的工业生产，这通过制造可获得的来自Hevea brasiliensis的酶(S)-羟腈裂解酶来实现，该酶例如被描述于WO 97/03204、EP 0 951561和EP 0 927 766中。

但是，存在多种令人感兴趣的化学物质，它们的R对映异构体对于工业应用来说是重要的。迄今为止，仅描述了可以以实验室规模使用的、制备大量产物的方法(例如，EP 0276375、EP 0326063、EP 0547655)。这些情况下使用的酶制剂主要是从蔷薇科(Rosaceae family)的植物获得那些，例如来自杏仁(Prunus amygdalus)的。目前已被使用的其它R-HNL例如是来自Phlebodium aureum的R-HNL，或者来自亚麻幼苗(Linum usitatissimum LuHNL)的那些，其作为R-HNL的第一个基因被克隆，并被表达于E.coli和Pichia pastoris中。

文献中描述的用于获得具有高光学纯度的有利反应参数是低温(例如Persson et al.；Enzyme and Microbial Technology 30(7)，916-923；2002)、低于4的pH(例如Kragl et al.；Annals of the New York Academy of Science；613(enzyme Eng.10)，167-75，1990)以及使用两相系统(例如EP 0547655)或乳液(例如EP 1238094)。

不幸的是，大多数R-HNL在低于4的pH具有少于1小时的半衰期。EP 1223220 A1描述了下述重组酶，它们是通过克隆来自Prunus amygdalus的编码R-HNL同工酶(例如同工酶5(PaHNL5))的基因，以及通过例如在Pichia pastoris中异源表达来制备的，从实施例中明显可见：因为较之其它已知R-HNL在低pH值下大幅增加的稳定性而使得它们不同于其它已知R-HNL。

已发现的不利之处在于，底物接受性令人不满意，因为在存在例如重组PaHNL5时，一些底物的转化较之存在商业可获得的来自杏仁的植物性天然(R)-HNL制剂的情况以显著更低的反应速率进行。

WO 2004/083424描述了这些重组HNL的突变体，其中来自手性中心中丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的组的残基被其它残基替换，导致底物接受性增加，特别是针对被取代的苯甲醛。一个例子是A111G突变体。

但是，该领域中对于下述酶仍有很大需求，所述酶首先可以以足够的工业规模提供，对于技术转化而言具有成本效益，并且其具有改善的底物接受性，由此具有增加的活性、增加的选择性以及增加的稳定性，有鉴于此，因此，本发明的目的是找到满足这些要求的来自Rosaceae科的R-羟腈裂解酶的新颖的突变体。

出人意料地，已可能可以通过对来自Rosaceae科的R-羟腈裂解酶(例如来自EP 1223220 A1的PaHNL5)的特定突变，来获得该目的。

本发明因此涉及具有改善的底物接受性、增加的活性以及增加的选择性的R-羟腈裂解酶，其特征在于：

在来自Rosaceae科的R-羟腈裂解酶的氨基酸序列中存在任何下述替换：

a)对应于成熟PaHNL5蛋白的第360位的氨基酸残基被另一种无极性氨基酸或中性氨基酸替换，和/或

b)对应于成熟PaHNL5蛋白的第225位的氨基酸残基被另一种极性氨基酸替换，

如果合适的话，还可能替换活性中心中或导向将被替换的活性中心的疏水通道中的大约1至20个额外的残基。

本发明的R-HNL是来自Rosaceae科的R-羟腈裂解酶的突变体。