[发明专利]蛋白分离和纯化

说明书

技术领域

本发明提供纯化在重组蛋白体样组装体(RPBLA)中积聚的重组蛋白的方法。更具体地，本发明提供分离重组蛋白体样组装体中的重组融合蛋白，所述重组蛋白体样组装体能够根据密度的不同允许从其它宿主细胞细胞器中进行分离，其中目的重组蛋白能够被浓缩、与其它细胞成分分离且容易回收。

背景技术

蛋白体(PB)是专用于蛋白质积聚的亚细胞细胞器(或较大的小泡，直径约1-3微米，被膜包围)。它们在诸如种子的某些特定植物组织中天然形成，并且作为用于萌发和幼苗生长的氨基酸的主要来源。

贮藏蛋白通过信号肽共翻译地插入内质网(ER)的内腔中，以便被包装在ER中或进入液泡中(Galili et al.，1993 Trends Cell Biol.3：437-443)并且在这些亚细胞区室中装配成多体单元，发育成被称为(ER)-衍生蛋白体(PB)或蛋白贮藏液泡(PSV)的特定细胞器(Okita andRogers，1996 Annu.Rev.Plant Physiol Mol.Biol.47：327-350；Hermanand Larkins，1999 Plant Cell 11：601-613；Sanderfoot and Raikel，1999Plant Cell 11：629-642)。

双子叶植物中的贮藏蛋白主要是可溶性蛋白，例如7S球蛋白或豌豆球蛋白型、11 S球蛋白或豆球蛋白型蛋白，并且与其它蛋白(即蛋白酶抑制剂、蛋白水解酶类、凝集素等等)、糖和盐一起被隔离在PSV中。

与PSV相反，PB(1-3微米)主要隔离谷醇溶蛋白且缺乏其它辅助蛋白，谷醇溶蛋白是谷类的高度疏水的贮藏蛋白(例如玉米的玉米醇溶蛋白和小麦的麦醇溶蛋白)(Herman and Larkins，1999 Plant Cell11：601-613)。

目前，除ER体外，尚未在除植物种子之外的组织中发现PB。ER体的大小较小(0.2-0.4微米)，并且只有在创伤和被昆虫咬食时才在拟南芥的叶子中形成而不在正常条件下发生(Matsushima et al.，2003Plant J.33：493-502)。

已使用遗传工程方法来研究植物PB的形成、贮藏蛋白的装配和靶向。已经显示当重组蛋白，主要是植物贮藏蛋白，在拟南芥和烟草中表达和包装时，本来不含有PB的植物组织(例如营养组织)“从头”产生出这些细胞器(Bagga et al.，1997 Plant Cell 9：1683-1696；Bagga etal.，1995 Plant Physiol.107：13-23；美国专利第5,990,384号、第5,215,912号和第5,589,616号；以及Geli et al.，1994 Plant Cell6：1911-1922)。

当在转基因烟草植株中表达时，叶细胞中玉米的β-玉米醇溶蛋白被正确地靶向在新形成的ER-衍生的PB中(Bagga et al.，1995 PlantPhysiol.107：13-23)。在拟南芥植株中表达的玉米γ-玉米醇溶蛋白和截短的γ-玉米醇溶蛋白cDNA也积蓄在叶子中新的ER-衍生的PB中(Geliet al.，1994 Plant Cell 6：1911-1922)。在玉米胚乳中表达的富含赖氨酸的γ-玉米醇溶蛋白(Torrent et al.1997 Plant Mol.Biol.34(1)：139-149)积蓄在玉米PB中并且与内源玉米醇溶蛋白共定位。表达α-玉米醇溶蛋白基因的转基因烟草植株证明α-玉米醇溶蛋白不能形成PB。然而，当α-玉米醇溶蛋白和γ-玉米醇溶蛋白共表达时，α-玉米醇溶蛋白的稳定性提高并且两种蛋白共定位在ER-衍生的蛋白体中(Coleman et al.，1996 Plant Cell 8：2335-2345)。在用富含蛋氨酸的10kDa δ-玉米醇溶蛋白转化的转基因大豆中也描述了新PB的形成(Bagga et al.，2000 PlantSci.150：21-28)。