[发明专利]液相色谱法

说明书

技术领域

本发明涉及使用连续液相色谱提纯一种或多种细胞成分如蛋白和/或肽的方法。本发明还包括适用于根据本发明的方法的色谱柱，以及用于提纯一种或多种细胞成分的试剂盒。

背景技术

为研究用途以及为制备新型药物，蛋白、肽、核酸和其它生物化合物的制造中程度越来越高地使用了生物技术方法。由于色谱的多面性以及对化合物的敏感性，色谱常常是该背景下的优选提纯方法。术语色谱包括一系列密切相关的分离方法，这些方法均基于彼此不互溶的两相得以接触的原理。更具体地，将目标化合物引入流动相，其与固定相接触。然后目标化合物在其被亦称作色谱基质的色谱流动相所载通过系统时，将会经历一系列固定相和流动相之间的相互作用。相互作用利用了样品中成分的物理或化学性质的差异。

色谱法可以在不同操作模式下进行。最简单的方式是批量色谱，其中将流动相加入到含有固定相的容器中，使目标化合物和固定相之间相互作用一段时间；取出流动相；加入洗脱剂，释放出目标化合物。另一方面，在重力色谱中，将相对少量地流动相加入到含有固定相柱的顶部。通过打开柱下端地开口，重力使流动相穿过柱子，在此期间其与固定相相互作用。洗脱常常通过向顶部施以少量洗脱剂进行，再次重力使其通过柱子。由于操作方式的原因，重力色谱柱的端部不需要有分布装置，简单的漏斗便可以胜任。在流化床色谱中，其亦称作膨胀床吸收(EBA)，将液流泵入底部含有固定相的柱内，从而将固定相变为流化相，液体在顶部收取。为了改善流动性质，固定相包括相对较重的小珠，该小珠通常由聚合材料制成但包括致密的核，例如钢。EBA中所用的柱子没有填有固定相。最后，在连续液相色谱中，将基本连续的流动相的流体施以包括固定相的柱子的顶部。通过将液体泵过柱子，在吸收阶段中保持流速可控的连续相。当固定相中的目标化合物达到合适的负载时，将液流从流动相改变成洗脱剂，任选地进行一次或更多次中间洗涤，在柱的出口处从洗脱剂中回收目标馏分。洗脱剂常常包括梯度，例如盐或pH梯度。为了避免被大的污染物所污染，并在柱子当中保持有利的液体分布，入口通常装有滤器和机械液体分布器装置。最常见地，入口类似地存在有滤器和一些机械液体分布器装置。

在称为固定化金属离子吸附色谱(IMAC)的色谱提纯方法中，利用了目标化合物与存在于固定相上的金属螯合基团之间的相互作用IMAC也称作金属螯合亲和力色谱(MCAC)，其常用于提纯蛋白。IMAC背后的原理在于，许多种过渡金属离子可以经由氨基酸侧练上的给电子基团与含S基团和含N基团配合，例如，这些基团例如氨基酸组氨酸、半胱氨酸和色氨酸中所存在者。为了在色谱用途中采用该相互作用，金属离子必须固定化在不溶性承载体上。这可以通过将螯合基团连接在载体上实现。最重要的是，为能使用，所选金属对基质的亲和力必须大于对待提纯化合物的亲和力。合适的配合离子的例子有Cu(II)、Zn(II)、Ni(II)、Ca(II)、Co(II)、Mg(II)、Fe(III)，Al(III)、Ga(III)、Sc(III)等。已知多种螯合基团可以用于IMAC，例如三齿螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)和四齿螯合剂次氮基三乙酸(NTA)。螯合基团通常称作配体，而不溶性承载体称作载体或基质。

近年来，IMAC已经成功地用于提纯重组蛋白和肽，其中引入组氨酸(His)标记以促进分离和提纯。当IMAC用于提纯重组蛋白时，在大多数常用方法中，细胞在第一步中溶解成游离蛋白，之后是离心和过滤，以出去细胞碎片和其它必然堵塞滤器和/或与配体不良吸附的残余物。随后将过滤的样品与结合缓冲液合并，加入至IMAC柱。

美国专利5,047,513(Dobeli)涉及适合于提纯蛋白、尤其是那些含有相邻组氨酸残基的蛋白的金属螯合树脂。所公开的蛋白提纯通过在下式定义的金属螯合物上对蛋白进行亲和力色谱而实现：

载体基质-连接基-NH--(CH₂)x--CH(COOH)--N(CH₂COO^-)₂Ni²⁺

因此，金属螯合亲和力配体为次氮基三乙酸衍生物，其通过使式R--HN--(CH₂)_X--CH(NH₂)--COOH的N-端保护的化合物与溴乙酸在碱性介质中反应，随后切除保护基，其中R表示氨基保护基，x表示2、3或4。