[发明专利]使用肽中间片段合成肽T－20

说明书

本发明涉及利用固相方法和液相方法用于制备T-20肽的方法，还涉及可以在这些方法中使用的T-20中间肽片段。更具体而言，本发明涉及使用两个片段制备T-20肽，其中所述的两个片段使用固相方法合成。

用于肽合成的众多方法在文献(例如，见美国专利第6,015,881号；Mergler等(1988)Tetrahedron Letters 29：4005-4008；Mergler等(1988)Tetrahedron Letters 29：4009-4012；Kamber等(编辑)，Peptides，Chemistryand Biology，ESCOM，Leiden(1992)525-526；Riniker等(1993)Tetrahedron Letters 49：9307-9320；Lloyd-Williams等(1993)TetrahedronLetters 49：11065-11133和Andersson等(2000)Biopolymers 55：227-250中描述。多种合成方法通过在其中合成进行的相的物理状态即液相或固相加以区别。

在固相合成(SPPS)中，氨基酸或肽基团结合至固相支持物树脂。随后，连续的氨基酸或肽基团连接在结合支持物的肽上，直至目的肽材料形成。随后，结合支持物的肽通常从支持物上切下并接受进一步加工和/或纯化处理。在某些情况下，固相合成产生成熟的肽产物；在其它情况下，从支持物中切下的肽(即“肽中间片段”)用于制备更大的成熟的肽产物。

从固相方法中生成的肽中间片段可以在液相合成方法(本文中称作“液相合成”)中偶联起来。液相合成可能在下列情况下特别有用，即此时通过固相合成有用的成熟肽是不可能的或是不可行的。例如在固相合成中，较长的肽在仍然连接在固相支持物上时最终可能获得不规则构象，因此导致终产物中的活性部分丧失或完全丧失。此外，当在支持物树脂上肽链变得更长时，加工步骤如偶联和去保护的效率可能受到损害。这接下来可以导致更长的加工时间以便弥补这些问题，此外还导致原材料如可活化氨基酸、共反应剂(co-reagents)和溶剂的损失增加。这些问题随肽的长度增加而增加，因此，找到仅使用固相方法合成长度大于30个氨基酸的成熟肽相当少见。

在液相偶联中，两个肽中间片段或者一个肽中间片段和一个活性氨基酸在适宜的溶剂中偶联，并且通常存在促进偶联反应效率和质量的额外试剂。肽中间片段以活性方式加以排列以致一个片段的氨基端与另一个片段的羧基端形成偶联，或一个片段的羧基端与另一个片段的氨基端形成偶联。此外，固相合成期间存在的侧链保护基在液相偶联期间通常保留在片段上以确保片段末端的特异反应性。一般不去除这些侧链保护基直至成熟肽已经形成。

为合成非常大的肽，对于多个待开展的液相偶联步骤而言使用三个或四个或多个肽中间片段并非罕见。当使用多个肽中间片段时，尽管在液相反应中末端对末端偶联反应的一般概念通常在理论上浅显易懂，但在实践中这几乎不可能。多种因素如杂质和肽产率可能显著地影响全长肽的质量和产率。因此，使用混合方案(hybrid schemes)合成肽往往具有挑战性，并且在很多情况下难以预测合成方案中的固有困难直至开展实际合成。

在某些情况下，液相合成可因固相合成后的肽中间片段纯度不够受到影响。就此而言，可能需要使肽中间片段在使片段于液相方法中偶联前接受纯化步骤处理。纯化则可能引起肽中间片段产率的降低，因此引起终末肽产物产率的降低。

成熟肽的产率还与合成成熟肽所需的液相步骤的数目成反比。在某些情况下，可能需要三个、四个或多于四个利用肽中间产物的液相步骤以生成成熟肽。每一额外的液相偶联步骤可以导致减少全长肽产物的回收。因此，为了提高总产率，通常需要使偶联中所涉及的步骤最少化。

对整体合成方案的一个或多个步骤中的适度改进可以引起成熟肽制备的显著改进。这样的改进可以引起时间和试剂的明显节约，并还可以显著地改善终产物的纯度和产率。