[发明专利]芸苔属植物的微弹轰击转化法

权利要求书

1.一种通过粒子轰击产生转化芸苔属细胞的方法，该方法包括：

(a)在轰击前，将由预孵育小孢子衍生的外植体在质壁分离的条件下培养约0.5小时至约4小时，所述外植体包含细胞；

(b)通过微弹轰击将DNA构建体导入外植体表面上暴露的细胞内，其中所述外植体处于质壁分离的条件下；和

(c)在质壁分离的条件下，将外植体继续培养约4小时至约20小时，以产生转化的芸苔属细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述质壁分离的条件选自(a)在渗透培养基上培养外植体，和(b)在湿滤纸上培养外植体。

3.权利要求1的方法，其中所述外植体是预孵育小孢子。

4.权利要求1的方法，其中所述外植体是由预孵育小孢子衍生的胚。

5.权利要求1的方法，其中所述外植体是由预孵育小孢子衍生的下胚轴。

6.权利要求1的方法，该方法还包括由转化细胞再生出转化植物的步骤，该步骤包括：

(a)在再生培养基上培养所述小孢子衍生的外植体以产生再生胚或组织；和

(b)由所述胚或组织再生出稳定转化的芸苔属植物。

7.一种通过权利要求6的方法所产生的稳定转化的植物或其子代。

8.权利要求7的稳定转化的植物或其子代，其中所述植物选自甘兰型油菜(Brassica napus)、白菜型油菜(Brassica rapa)、芥菜型油菜(Brassica juncea)、野甘蓝(Brassica oleracea)、埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata)和黑芥(Brassica nigra)。

9 一种通过权利要求6的方法由稳定转化的植物或其子代产生的植物细胞。

10.权利要求9的植物细胞，其中所述植物或其子代选自甘兰型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、野甘蓝、埃塞俄比亚芥和黑芥。

11.权利要求8的植物或其转化子代，其中所述植物或其子代是甘兰型油菜。

12.一种通过权利要求1的方法产生的植物细胞。

13.权利要求12的植物细胞，其中所述植物细胞选自甘兰型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、野甘蓝、埃塞俄比亚芥和黑芥。

14.权利要求13的植物细胞，其中所述植物细胞是甘兰型油菜植物细胞。

15.一种产生稳定转化的芸苔属植物的方法，该方法包括：

(a)通过微弹轰击将DNA构建体导入预孵育小孢子内；

(b)培养预孵育小孢子以产生胚或组织；和

(c)由胚或组织再生出稳定转化的芸苔属植物。

16.权利要求15的方法，其中步骤(a)中，在轰击前，将新鲜小孢子在培养基中培养一段时间以产生预孵育小孢子，其中所述一段时间在约2天至约10天的范围内。

17.权利要求15的方法，该方法还包括在轰击前、轰击期间及轰击后诱导预孵育小孢子质壁分离的步骤。

18.权利要求17的方法，其中所述诱导质壁分离的步骤选自(a)在轰击前、轰击期间及轰击后，在渗透培养基上培养预孵育小孢子，和(b)在轰击前、轰击期间及轰击后，在湿滤纸上培养预孵育小孢子。

19.权利要求18的方法，其中将所述预孵育小孢子在渗透培养基上在轰击前大约培养0.5小时至4小时，在轰击后大约培养4小时至20小时。

20.权利要求15的方法，该方法还包括轰击后的筛选步骤，该步骤包括将经过轰击的预孵育小孢子在培养基中或在培养基上进行培养，所述培养基含有针对DNA构建体编码基因的选择剂。

21.权利要求15的方法，其中所述选择剂选自卡那霉素、G418和草甘膦。

22.权利要求15的方法，该方法还包括在轰击前使预孵育小孢子定向以便在轰击期间使小孢子表面暴露出来的步骤。

23.权利要求15的方法，该方法还包括在轰击前收集有存活力和胚发生的预孵育小孢子的步骤。