[发明专利]芸苔属植物的微弹轰击转化法

说明书

发明领域

本发明领域涉及植物的遗传工程，具体地说，涉及芸苔属(Brassica)植物的遗传转化方法。

发明背景

芸苔属各品种均可用作植物油、动物饲料、蔬菜和调味料的来源。用作蔬菜生产的芸苔属植物包括卷心菜、花椰菜、青花椰菜、羽衣甘蓝、球茎甘蓝、雪里蕻和芜菁甘蓝。白芥(B.hirta)的种子被用来生产颇受欢迎的美国调味品黄芥末酱。然而，在全球性基础上，芸苔属品种最重要的经济用途是由种子获得的植物油产品。种植用于油品生产的主要芸苔属品种是甘兰型油菜(B.napus，亦称欧洲油菜)，其次是芥菜型油菜(B.juncea，亦称芥菜)和白菜型油菜(B.rapa，亦称芜青)。甘兰型油菜、芥菜型油菜和白菜型油菜的种子都被称为油菜籽。所种植的主要用于油品生产的芸苔属品种常被称为含油种子油菜。在北美，一直被用来筛选种子中低水平的芥子酸和芥子油苷的一类含油种子油菜-双低油菜(canola，亦称甘兰型油菜)，是为了生产人类消费用植物油品而种植的主要芸苔属植物。虽然低芥子酸油菜籽油，例如甘兰型油菜油，可能有利于人类消费，但是高芥子酸油菜籽油也是多种工业应用所需要的，包括用于化妆品、润滑剂、增塑剂和表面活性剂的生产。

因为芸苔属植物在农业和工业上的重要性，所以植物育种人员正致力于开发农艺性状改良的新品种。虽然传统育种方法十分重要，但是最近通过遗传转化方法，在栽培芸苔属品种中，将重组DNA导入芸苔属基因组的研究取得了重大进展。许多经遗传修饰的芸苔属品种已经种植在北美农场主的田间。经遗传修饰而具有除草剂抗性的转基因甘兰型油菜品种，迅速获得横贯美国和加拿大甘兰型油菜种植区农业生产者的青睐。转基因甘兰型油菜品种在北美取得的重大成功加速了新的甘兰型油菜转基因品种的开发。对于甘兰型油菜和其它芸苔属品种，正在开发基于重组DNA的掺入新性状的新策略，所述新性状例如抗病、抗虫、改良种子油组成和改良种子蛋白质组成。所有这些策略都依赖于将重组DNA导入芸苔属植物基因组的遗传转化方法。

最近，芸苔属品种最有利的转化方法包括利用土壤杆菌。虽然基于土壤杆菌的转化方法为将外源DNA导入植物提供了可靠的方法，但是涉及利用土壤杆菌的植物转化法存在许多缺点。首先，所有基于土壤杆菌的方法不理想的结果是将至少一个T-DNA边界序列(T-DNAborder)导入受体植物基因组。虽然T-DNA边界序列是土壤杆菌将DNA转移到植物细胞遗传机制的必不可少的元件，但是T-DNA边界序列却不是外源基因在受体植物中表达所必需的。另外，整个植物基因组中多个T-DNA边界序列的累积可能对植物或其子代产生有害作用。其次，植物组织与土壤杆菌共培养可能减缓从转化细胞再生出转化植物。共培养期后，必需从植物组织培养物中清除土壤杆菌。必须将高水平的杀细菌剂应用到植物培养物中以杀死土壤杆菌。虽然培养物中所用的杀细菌剂水平一般对植物组织不是致死的，但是培养物中存在的杀细菌剂可能对植物生长产生负面影响，因此减缓转化植物的再生。第三，在DNA转移到植物中之前，土壤杆菌中可能发生天然的遗传过程，例如遗传重组和DNA重排，这可能对转移到植物中的DNA片段产生不良作用。这种不良作用可能改变或清除已导入DNA片段的既定遗传功能。

有效但不涉及利用土壤杆菌的芸苔属转化方法是十分需要的。US6,051,756、US 6,495,741、US 2003/0093840和US 2004/0045056记载了用粒子轰击对幼苗下胚轴的转化。US 6,297,056记载了子叶柄的转化。US 6,515,206和US 2003/0200568记载了真叶中质体转化的用途。Chen和Beversdorf(Theor.Appl.Genet.88：187-192(1994))描述了涉及DNA吸涨的小孢子衍生下胚轴的生物射弹转化方法(biolistictransformation procedure)。Fukuoka等(Plant Cell Reports 17：323-328(1998))描述了新生小孢子的生物射弹转化。最后，Nehlin等(PlantPhysiol.第156卷：175-183(2000))描述了预孵育小孢子的瞬时生物射弹转化，但是没有报道稳定的转基因植物。

为了满足当今全球对农业日趋增加的需求，必须加快开发甘兰型油菜和其它芸苔属品种的转基因新品种的步伐。加快芸苔属品种的开发步伐取决于有效可靠的转化方法以及转化的芸苔属植物有效可靠的再生方法。

发明概述