[发明专利]痕量二恶英的生物检测方法

权利要求书

1.一种痕量二恶英的生物检测方法，其特征在于：

a.小鼠肝组织中抽提总RNA，通过逆转录PCR扩增目的基因AhR、ARNT、AhR1，酶切产物纯化后与pGEX-5X-1质粒进行连接，构建了含外源目的基因的重组质粒；

b.制备感受态细胞及转化重组质粒，进行融合蛋白GST-AhR、GST-ARNT、GST-AhR1的诱导表达与纯化；

c.将大量表达的ARNT全长融合蛋白GST-ARNT与从C57BL/6J纯系小鼠中提取的富含AHR的胞浆提取液在TCDD存在的条件下温育结合，得到二聚体复合物；

d.利用Glutathione Sepharose 4B珠子对该二聚体复合物进行亲和吸附，用目的蛋白GST-AhR1制备的多克隆免疫血清为一抗，通过免疫印渍方法对二聚体复合物的结合情况进行检测。

2.根据权利要求1所述痕量二恶英的生物检测方法，其特征在于：

AhR全长：

上游引物  5′-gatgagcagcggcgccaac-3′

下游引物  5′-ggccggctcgagtcaactctgcaccttgctta-3′

下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子TCA；

ARNT全长：

上游引物  5′-ccggccgaattcatggcggcgactacagc-3′

下游引物  5′-ggccggctcgagctattcggaaaagggggga-3′

上游引物加入了EcoR I的酶切位点，下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子CTA；

AhR1：

下游引物  5′-ggccggctcgagtcagggcagcgacgtacttc-3′

下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子TCA。

3.根据权利要求1所述痕量二恶英的生物检测方法，其特征在于取目的蛋白GST-AhR1与等体积的弗氏完全佐剂混匀，并充分乳化，免疫家兔，得到实验所需的多克隆免疫血清。

4.根据权利要求1所述痕量二恶英的生物检测方法，其特征在于酶切产物纯化后与质粒载体进行连接是将目的基因AhR、ARNT、AhR1与pGEX-5X-1质粒按3∶1的比例混合在T4 Ligase作用下室温进行。

5.根据权利要求1所述痕量二恶英的生物检测方法，其特征在于向富含AhR的C57BL/6J小鼠肝细胞提取液中加入融合蛋白ARNT和不同浓度的TCDD样本，于由25mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.2mM乙二胺四乙酸二钠，10％丙三醇，200mM NaCl，0.1％乙基苯基聚乙二醇制备的pH为7.4的结合缓冲液中在20℃振荡孵育2小时得到二聚体复合物。