[发明专利]痕量二恶英的生物检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及包含有核酸的检测方法，确切的说是一种通过分子生物学方法进行的基于芳香烃受体系统的痕量二恶英的生物检测方法。

发明背景

二恶英(dioxins)是一类毒性很强的化合物的总称，慢性毒性研究已经证明其具有极强的致癌性、致畸性、免疫毒性、生殖毒性、肝毒性等。因其对人类健康危害非常大，日益成为当前的一个研究热点。二恶英类化学物质(dioxin-type chemicals，DTCs)主要包括：多氯代二苯并二恶英(polychlorinated dibenzo-p-dioxins，PCDDs)，多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzo-p-furans，PCDF)和多氯联苯(polychlorinated biphenyls，PCB)，其中只有2，3，7，8四个共平面取代位置均为氯原子的17种二恶英同族体才有毒，其中研究最多也是最典型和毒性最强的物质为2，3，7，8-四氯代二苯并二恶英(TCDD)被认为是世界上毒性最强的化合物。但由于二恶英检测和分析费用昂贵，目前我国仅能进行少量样品的检测，对二恶英造成我国食品的危害程度还不完全清楚。因此，建立一种经济、快捷的食品中二恶英检测方法日益成为目前食品卫生检测工作中的重点。

目前二恶英类化学物质检测方法的研究主要集中于色谱法、免疫法和生物检测法三大类。

尽管目前认为高分辨气相色谱与高分辨质谱联用技术(HRGC-HRMS)是目前唯一适合的分析方法，但由于化学分析方法所使用的仪器价格昂贵，试样需多步分离、净化步骤十分繁琐，这一工作在大多数实验室不能开展。

色谱学方法是目前国际公认的检测二恶英类化学物质的标准方法，尤其是高效毛细管色谱加高分辨率质谱(以选择性离子方式)。其优点：可以分离混合物中的每种组分，并进行准确的定量。其缺点：需要有复杂的样品前处理过程，通常需要数天；要求有精密的仪器、良好的实验环境和训练有素的操作人员；需要标准品来进行定性和定量，但目前有些标准品还不具备；一般检测一个二恶英样品需要耗时数周至一个月，而且成本昂贵；色谱法仅能反映样本的二恶英类化学物质总量，并不能反映其生物效应。

免疫学方法以其选择性好、灵敏度高，在很多方面得到了应用。检测原理为放射性碘(¹²⁵I)标记的二抗与二恶英竞争性地与一抗结合，然后通过检测沉淀物中放射性的减少来定量。虽然所需时间较短，操作相对较简单，对检测人员要求相对较松；检测样品的费用也较便宜。但利用二恶英为半抗原来免疫动物获得多克隆抗体这种方法有其自身的缺陷，首先用二恶英同系物与血清白蛋白偶联免疫家兔制备的抗体只能特异性识别这种特异性的抗原或某种与其结构/抗原性非常相似的物质。一方面针对不同待测物质需要制备不同的抗体，比较繁琐不适合对二恶英污染的筛查和检测工作；另一方面某些与其结构/抗原性相似的混杂物会对其造成假阳性的干扰。其次加之由于抗原本身对免疫宿主就有毒性，在一定程度上加大了获得高效价抗体的难度。

生物学方法与色谱学方法比较，虽然不能检测二恶英类化学物质的各个成分，但它简便、快速、费用低，并且能更准确地反映二恶英类化学物质对机体的影响。但是通过检测特异基因的表达产物来反映二恶英类化学物质的量，需要将样本的抽提物与细胞共同培养数天，收集细胞、裂解细胞、离心收集上清用于检测酶活性。这种检测方法需要进行细胞培养，检测周期比较长。虽然，细胞培养难度不大，但是极容易发生污染，为了防止污染要求有清洁度比较高的专门的细胞培养室，常常需要专门的细胞培养人员参与。

中国专利1661089A公开了一种“痕量二恶英的生物检测方法”，其是将二恶英与芳香烃受体形成的复合物与特异性核酸序列结合并保护其免受核酸外切酶III和核酸酶S1的降解，然后利用核酸扩增技术检测复合物结合保护的特异核酸序列，复合物结合的核酸序列与二恶英的量程比例关系。

发明内容

本发明就是为了解决现有技术中二恶英检测和分析费用昂贵，过程复杂，耗时较长的问题，而提供一种便捷、经济、快速的痕量二恶英的生物检测方法。