[发明专利]人促造血细胞增殖的细胞因子及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞因子，尤其是一种人促造血细胞增殖的细胞因子及其制备方法和用途。

背景技术

后基因组时代是蛋白质结构与功能的研究时期。随着生命科学理论的的不断完善，实验技术的不断发展，越来越多的结构性蛋白被发现在机体内发挥着举足轻重的生理功能。pNH是结构蛋白糖蛋白4(PRG4，又称SZP，关节滑膜蛋白)的一个不同剪接体形式，由PRG4的部分第2外显子、完整的第3外显子和部分第6外显子组成；cDNA序列5’端两个外显子分别编码两个促细胞生成素B(SMB)结构域，3’端外显子编码PTT/XP黏液素样重复序列。其中第一个SMB结构域N端缺失15个氨基酸，此序列内包含一对二硫键。1972年一个依赖于生长激素发挥功能的血清生长因子被命名为促细胞生成素B(Somatomedin B，SMB)。它能够刺激神经胶质细胞DNA的合成。在人血浆和hemofiltrate中都能检测到游离的可溶性SMB蛋白。其后，不同的研究小组发现不少蛋白中含有与SMB同源的序列，称为人促细胞生成素B样结构域(SMB like domain)，含有39到51个氨基酸残基不等。

1999年Flannery从培养的牛软骨单层细胞，2001年Gregory等从人关节滑液成纤维细胞和关节软骨细胞中RT-PCR SZP序列时得到SZP第4、第5外显子缺失的全长产物，作为鉴定用，但是没有进行进一步的表达活性鉴定等工作。

SZP/MSF的SMB结构域Cys位点与玻连蛋白(Vitronectin，Vn)SBM结构域有同源性，但是Cys的旁侧序列完全不同。两者的这一结构域在功能上有很大的差异，后者能结合PAI-1，而MSF则不能；显示了两者在功能上的差别。为研究二硫键拓扑结构，2002年Kamikubo曾表达了人Vn的SMB结构域。

目前造血干细胞体外培养扩增技术尚未完全成熟。培养过程中干细胞数量不足，易分化等问题有待解决。在培养体系中加入一定的细胞因子成为手段之一。比如能刺激定向分化的祖细胞的扩增的IL-3，对巨噬祖细胞有刺激作用的GM-CSF，TPO作用于巨核祖细胞，SCF促进造血干细胞扩增。在血液病治疗药物研究过程中，红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)，粒细胞克隆形成刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)和粒细胞-巨核细胞刺激因子(granulocyte-macrophage stimulatingfactor，GM-CSF)是三个已被批准用于肿瘤治疗的细胞因子，在治疗化疗后的贫血和嗜中性白细胞减少症状中功效显著。人白介素3受体高亲合的配体类似物，(Synthokine)，人白介素3和G-CSF受体激活剂(myelopoietin MPO)，和刺激人IL-3、c-mpl受体的promegapoietin(PMP)能刺激多分化潜能的造血祖细胞的增殖，正在接受临床实验。其中，EPO是首个利用克隆技术基因重组表达的造血相关的生长因子，用于调节肿瘤相关的贫血。发现并研究新的细胞生长因子应用于血液细胞培养体系是当前的研究重点之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种人促造血细胞增殖的细胞因子及其制备方法和用途，即pNH。包括pNH cDNA的克隆及在原核中的表达，重组蛋白的制备纯化，物理化学特性和生物学功能的鉴定。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种人促造血细胞增殖的细胞因子，所述人促造血细胞增殖的细胞因子pNH由SEQ ID NO.2所列氨基酸序列的蛋白质组成。

编码pNH的cDNA分子，由SEQ ID NO.1所列核苷酸序列的全部或片段。

一种编码pNH的cDNA的克隆方法，包括以下步骤：

1)根据SEQ ID NO.2所列氨基酸序列，用已知的遗传密码推测出与这些氨基酸相应的核苷酸序列；

2)设计特异性引物，以pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，所述特异性引物为：扩增pNH的片段的上游引物为5’-GCCATGGATGCCACCTGCAACTGTGAT-3’，下游引物为5’-gCCTCgAgAGTTGTGACCTTGAAGTCACCAT-3’。

3)用特异性cDNA扩增产物作为探针，从人cDNA文库中筛选出pNH的cDNA，所述特异性cDNA扩增产物为编码1)所述的pNH氨基酸序列的核苷酸。

所述人cDNA文库为人胚胎肝细胞cDNA文库。

一种表达pNH的质粒，含上述方法所得到的cDNA。