[发明专利]一种亲和人白蛋白核酸适配子的制备与用途

说明书

(一)技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种与人白蛋白具有高特异性和高亲和性结合能力的核酸适配子的制备与用途。

(二)背景技术

人白蛋白由肝细胞生成，主要存在于血浆，具有广泛的生物学功能，临床大量需要白蛋白的输入治疗，以及体液中白蛋白的检测辅助疾病的诊断。如：血中白蛋白浓度的增高常见于严重失水而导致的血浆浓缩，降低则多见于慢性肝炎、肝硬化、肝癌、肾炎等肝脏、肾脏疾病。尿中微量白蛋白的检测对一些肾病功能失调的病症是一个较尿常规或尿总蛋白检查更为敏感的指标，特别是在慢性肾功能损伤性疾病，如糖尿病性肾病、高血压、系统性红斑狼疮等疾病过程中，微量白蛋白尿的检测对提示肾脏功能改变更具有敏感性。最近的一些研究认为，微量白蛋白尿不仅是糖尿病并发症早期诊断的指标，而且对高血压和心血管疾病的发生、发展、预后、治疗效果评价等也具有重要参考价值，该指标阳性是血管广泛损伤的早期标志和独立危险因素。因此微量白蛋白尿检查的应用范围已经扩大到作为心血管疾病、高血压等疾病的常规检查项目，通过这一检查可以发现潜在病变，为疾病的早期诊断、早期治疗提供有用的信息及实验室指标。目前，常用测定微量尿蛋白的方法是放射免疫法，还有人进行酶联免疫测定试剂盒的研制。

系统进化指数富集技术(SELEX技术)是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)。该技术已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。

(三)发明内容

本发明的目的是通过系统进化指数富集技术(SELEX技术)筛选人白蛋白的寡核苷酸适配子来替代抗体，提供一种简洁快速、高灵敏度、高特异性的人白蛋白早期检测及分离纯化方法。

本发明的技术方案：

本发明中用于系统进化指数富集技术筛选的单链DNA随机文库及引物，由美国invitrogen公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列：5′-ATCCGCCTGATTAGCGATACT-(N35)-ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG-3′，库容量为10¹⁴以上；

引物1：5′-ATCCGCCTGATTAGCGATACT-3′；

引物2：5′-biotin-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3′；

引物3：5′-biotin-ATC CGCCTGATTA GCGATACT-3′；

引物4：5′-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3′。

人白蛋白购于天津华生生物科技有限公司；

GelRed核酸染料购于Biotium公司；

硝酸纤维素滤膜购于美国密理博(MilliPore)公司；

寡聚核苷酸的纯化试剂购于北京天为时代公司；

PCR试剂盒和T载体购于美国普洛麦格(Promega)公司。

一种亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于核苷酸序列为：ATCCGCCTGATTAGCGATACTGGGACTGACTGATACGAAGGCATGATTGGGACACTACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGG或ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCGGAATTGGATGAATCGGGACCACGCGAGTATATACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG所示的DNA分子。

一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于：单链DNA序列为附图1所示的両种结构之一。

一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于：具有相同功能的寡核苷酸适配子同源序列占60％以上。

一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于：衍生的RNA序列具有相同的功能。

一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于：为能与DNA序列进行杂交的寡核苷酸序列。

一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的寡核苷酸适配子序列具有相同的功能。

一种上述亲和人白蛋白核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位置进行核苷酸种类和稀有碱基的置换后，得到的寡核苷酸适配子序列具有相同的功能。