[发明专利]一种动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测技术

说明书

[发明领域]

本发明涉及动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测方法，属于医学分子生物 学领域，具体是关于动物源细菌四环素类药物耐药基因多重PCR检测方法及其在耐药性检 测中的应用。

[背景技术]

四环素类药物(Tetracycline，TET)是一类碱性广谱抗生素，包括由链霉菌产生金霉素、 土霉素、四环素和去甲金霉素等以及半合成的多西环素和米诺环素。前者在我国较为常用。 四环素类药物目前主要用于立克次体、衣原体、支原体及回归热螺旋体等非细菌性感染和 布氏杆菌病，以及敏感菌引起的呼吸道、胆道、尿路及皮肤软组织等部位的感染。兽医临 床上多用土霉素治疗肠道多种病原菌感染。如沙门菌引起的犊牛、雏鸡白痢及大肠杆菌性 仔猪黄痢、白痢；鸡巴氏杆菌引起的禽霍乱；对猪喘气病和猪肺疫也有效，与卡那霉素联合 使用可提高疗效；局部应用于各动物组织中坏死杆菌感染引起的坏死或子宫脓肿炎症；可用 于血抱子虫感染的牛边缘边虫病、泰乐焦虫病、钩端螺旋体病等。

随着四环素类药物广泛而大量的使用，对这类抗生素耐药的耐药菌株也越来越多，而 由于化学结构相似还易产生交叉耐药，耐药谱也越来越广，这极大限制了四环素类抗生素 的发展。目前，通过DNA-DNA杂交，已鉴定出三十多种四环素耐药基因，其中革兰氏阴性菌 32种，革兰氏阳性菌22种，且常见于多重耐药菌株。

目前我国畜禽耐药性检测控制与畜产品安全生产中，在四环素类药耐药性检测研究方 面，对病原菌耐药性基因的研究开展得少，尚无配套的检测试剂盒。传统方法是通过测定 细菌的最低抑菌浓度或抑菌圈大小测定细菌的耐药性。传统的药敏试验必须经过繁琐的细 菌分离纯化、繁殖扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于临床上及时的选 药治疗。同时，药敏试验是在体外用药物试探性的检验细菌的表型耐药特性，不能检测细 菌的隐型耐药性。

国内外已经从分子水平开展了细菌耐药机理的研究和耐药性相关基因的分子检测。从 分子水平进行细菌耐药性的检测，不仅大大地缩短常规检测的时间，还能够查明细菌耐药 性的传播及流行趋势，为控制耐药菌株的产生和流行，新型兽药的研制提供科学的依据， 目前，耐药基因检测方法主要有质粒图谱、质粒指纹图谱、质粒消除试验、PCR及PCR- 限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)、Southern blot、 Dot blot、核酸探针检测、DNA的序列测定等。其中，PCR技术具有敏感、特异、快速等 优点，可以检测极微量的目的基因进行检测，而不需要经过费时的细菌培养阶段，广泛的 应用于细菌耐药性研究。而多重PCR技术是在同一反应体系中加入多对引物对多个目的基 因同时进行扩增。它在检测基因过程中可设立内部对照；可指示出模板的数量；可同时扩 增几个目的基因；消耗的时间和试剂少，减少准备时间提高效率；可大量地进行样品和目 的基因的检测。自从Chamberlain(1988)首次应用多重PCR扩增多个人类肌营养不良蛋白基 因以来，多重PCR已发展成为一种通用技术，广泛应用于病原体鉴别、性别筛选、连锁分 析、法医研究、模板定量和遗传疾病诊断。在病原体鉴别方面具有突出的优点，多重PCR 方法可指示许多病原体中的某一个，或区分同一属中的种或株。近年来，多重PCR技术越 来越广泛的应用于细菌耐药性的检测上。

[发明内容]

本发明的目的是提供一种快速检测动物源细菌对四环素类药物耐药基因的多重PCR检测 方法

本发明的目的是通过以下方法方案达到的：