[发明专利]检测黑麦草腥黑穗病菌的引物、探针及方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业和植物检疫，尤其涉及一种黑麦草腥黑穗病菌的检测方法，以及该检测方法使用的引物与探针。

背景技术

小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica Mitra)是世界关注的危险性有害生物，也是我国对外公布的一类危险性有害生物，主要分布在印度、巴基斯坦、伊朗、伊拉克、尼泊尔、阿富汗、巴西、墨西哥、美国和南非等地。黑麦草腥黑穗病菌(Tilletia walkeri)是类似小麦印度腥黑穗病菌的新种，近年随着粮食市场的开放，进口粮食数量的不断增加，黑麦草腥黑穗病菌传入的机会和风险也增加了，特别是主要粮食出口国美国也有黑麦草腥黑穗病菌的发生，给我国口岸检疫带来病菌检测的新难题。目前常用的检测和鉴定方法是形态特征鉴定和常规PCR技术。形态特征鉴定需要丰富的经验和一定数量的病菌冬孢子。常规PCR技术需要冬孢子萌发培养繁殖得到菌丝，整个处理和鉴定的过程长达2-3周，而且冬孢子休眠和不具存活力也影响病菌的鉴定。如果直接检测孢子，从孢子中提取DNA再PCR检测，需要的孢子量比较大，在实际的检测过程中难以得到大量的孢子，而且实际的样品中可能存在几种病菌孢子。因此以上两种鉴定方法的实用性受到一定的限制。

Frederick等(2000)报道了利用TaqMan探针进行小麦印度腥黑穗病菌实时荧光PCR检测方法。章桂明等(2002)也建立了小麦印度腥黑穗病菌的实时荧光PCR检测方法(未发表)。已报道的实时荧光PCR方法的探针都是针对小麦印度腥黑穗病菌的线粒体序列，而线粒体序列的变异速率比核糖体序列变异速率更大，核糖体序列更为保守和稳定。因此，针对黑麦草腥黑穗病菌的核糖体序列设计特异性探针，建立黑麦草腥黑穗病菌的实时荧光PCR检测方法，可达到快速、准确地检测与鉴定的效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供用于检测黑麦草腥黑穗病菌的引物。

本发明要解决的技术问题之二是提供用于检测黑麦草腥黑穗病菌的探针。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种检测黑麦草腥黑穗病菌的方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了用于检测黑麦草腥黑穗病菌的引物，它包含15个或更多个连续核苷酸的一条链或其互补链，其中一个或多个核苷酸是SEQ ID NO.1序列的32、57、258、277中任何位点的核苷酸。

较佳地，所述引物含有：5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’或其互补链；5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’或其互补链。

在本发明的另一方面，提供了用于检测黑麦草腥黑穗病菌的探针，它包含15个或更多个连续核苷酸的一条链或其互补链，其中一个或多个核苷酸是SEQ ID NO.1序列的67、78、82中任何位点的核苷酸。

较佳地，所述探针含有(FAM)-CGGAAGGAACAAGGC-(MGB)或其互补链。

在本发明的另一方面，提供了一种检测黑麦草腥黑穗病菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取冬孢子DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列的引物进行第一轮PCR扩增；

(3)以步骤(2)的PCR产物为模板，用权利要求1所述的引物进行实时荧光PCR扩增；

(4)分析步骤(3)的实验结果。

较佳地，步骤(3)中所述的引物为具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3序列的一对引物。

由于采用上述技术方案，本发明的检测黑麦草腥黑穗病菌的方法使检测时间大大缩短，八个小时内即可完成检测，而传统的检测方法需二至三周以上，且本发明单个冬孢子就可检测，灵敏度有效提高，而传统的检测方法需100个孢子以上，此外，本发明能同时检测两种病菌冬孢子，而传统的常规检测方法不能同时检测两种病菌冬孢子。

附图说明

图1是本发明的检测黑麦草腥黑穗病菌的流程图；

图2是本发明的引物和探针位置图；

图3是本发明的单个冬孢子的实时荧光PCR检测实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。