[发明专利]重组酵母基因工程菌pPICZαA－K1－KDR(1－3)/GS115的制备方法

权利要求书

1.一种重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制备方法，其特征在于该方法，包括以下步骤：

a.重组质粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的构建：融合基因K1-KDR(1-3)包括2个功能域片段和1段连接臂，2个功能域片段分别是：K1基因和KDR(1-3)基因；1段连接臂是：连接K1基因和KDR(1-3)基因的柔性连接臂(Gly)₃；其构建方法包括如下步骤：

(1)重组质粒pPICZαA-K1的构建；

(2)重组质粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的构建；

b.重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的构建。

2.根据权利要求1所述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制备方法，其特征在于所述的重组质粒pPICZαA-K1的构建方法为：设计K1的上下游引物：

上游引物：5’-GCCGAATTCGTGTATCTCTCAGAG-3’；

下游引物：5’-TTTGGTACCGCCACCTTCCTCTTCACAC-3’。

以K1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约270bp的K1片段，K1片段用EcoRI和KpnI双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/KpnI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。

3.根据权利要求1所述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制备方法，其特征在于所述的重组质粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的构建的方法为：设计KDR(1-3)的上下游引物：

上游引物：5’-GGTGGTACCAGTGTTTCTCTTGATCTG-3’；

下游引物：5’-GGGTCTAGAGGTTTTTCATGGACCCTGAC-3’。

提取人脐静脉内皮细胞的总RNA，设计引物进行RT-PCR，得到KDR(1-3)的cDNA。以KDR(1-3)的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约900bp的KDR(1-3)基因，KDR(1-3)片段用KpnI和NotI双酶切后插入重组质粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)；转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。

4.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白K1-KDR(1-3)的制备方法，其特征在于所述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的构建的方法为：重组质粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)用Sac I线性化后，电击转化毕赤酵母GS115，将电击后的混合液涂布在Zeocin浓度分别为100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培养2～4天，待克隆长出。