[发明专利]重组酵母基因工程菌pPICZαA－K1－KDR(1－3)/GS115的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制备方法。

背景技术

恶性肿瘤即癌症，是威胁人类健康的最严重的疾病之一。恶性实体肿瘤的常规治疗包括手术摘除、化学治疗、放射治疗等，这些治疗方法存在易复发，对人体的毒副作用大，会诱导抗药性产生等不理想之处。生命科学基础研究的突破和生物技术的发展，为恶性肿瘤的最终攻克提供了其他更加有效和可行的手段。

20世纪70年代初，Folkman博士提出“肿瘤增殖具有血管依赖性”的观点，即体积超过1mm³～2mm³的肿瘤需要新生血管维持营养和氧气的供给并且排出代谢产物，还需要新生血管提供转移的通道。从这个观点出发，提出一种治疗肿瘤的新策略，即不直接从正面攻击肿瘤，而是阻断肿瘤的营养供应，间接地抑制肿瘤生长，使其处于休眠状态。这就是抗血管生成疗法，也被形象地称为肿瘤的“饿死疗法”。

抗血管生成疗法是近几年来肿瘤生物治疗研究的热点，与以往的方法相比，有着显著的优越性：①广泛的抑瘤谱；②不易产生耐药性；③无明显毒副作用；④药物易于到达靶部位；⑤可同时治疗肿瘤的转移；⑥与化疗和放疗有协同作用。目前已发现了多种血管生成抑制剂，有数百种药物进入了临床试验阶段，大多数处于二期临床，有十几种药物进入了三期临床，它们都显示出了初步疗效和光明的治疗前景。

血管抑素(Angiostatin)是人纤溶酶原(Plasminogen)的kringle 1-kringle4区域，具有抑制血管内皮细胞增殖的能力。目前血管抑素已进入一期临床试验。其中K1(Kringle 1)不仅能有效抑制内皮细胞的增殖，还具有结合赖氨酸的能力(可以用赖氨酸亲和柱纯化蛋白)。

血管内皮生长因子受体(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR)是位于内皮细胞上的一类跨膜受体，它与VEGF结合后能促进内皮分裂增殖、增生、转移，增加血管通透性并促进新血管生成。KDR，即VEGFR-2，是其中重要的亚类。KDR的Kringle1-3区域具有结合VEGF的能力，但是不能催化酶反应的发生。所以KDR(1-3)一方面能竞争性地结合VEGF，另一方面，配体/受体复合物KDR(1-3)/VEGF不能催化酶反应，所以有效抑制了血管新生的发生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115 的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的制备方法，其特征在于该方法，包括以下步骤：

a.重组质粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的构建：融合基因K1-KDR(1-3)包括2个功能域片段和1段连接臂，2个功能域片段分别是：K1基因和KDR基因的Kringle1-3区域；1段连接臂是：连接K1基因和KDR基因Kringle1-3区域的柔性连接臂(Gly)3；其构建方法包括如下步骤：

(1)重组质粒pPICZαA-K1的构建；

(2)重组质粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的构建；

b.重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115的构建；

上述的重组质粒pPICZαA-K1的构建方法为：以K1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约270bp的K1片段，K1片段用EcoRI和KpnI双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/KpnI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。

上述的重组质粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)的构建的方法为：提取人脐静脉内皮细胞的总RNA，设计引物进行RT-PCR，得到KDR(1-3)的cDNA。以KDR(1-3)的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约900bp的KDR(1-3)基因，KDR(1-3)片段用KpnI和NotI双酶切后插入重组质粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1-KDR(1-3)；转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。