[发明专利]重组人白细胞介素－4的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人白细胞介素-4(IL-4)的方法，包括有关的工程菌的构建、重组人白细胞介素-4的表达和纯化工艺。

背景技术

1982年，Howard发现T细胞培养上清中有一种促进B细胞增殖的生长因子，起初命名为B细胞生长因子-1(B cell growth factor-1，BCSF-1)。有的实验室称B细胞刺激因子(B cell stimulating factor-1，BSF-1)、T细胞生长因子-2(T cellgrowth-2，TCGF-2)。1986年基因克隆成功，国际统一命名为白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)。

IL-4是由辅助T细胞(Th细胞)产生的细胞因子，主要作用于B细胞，它能够激活处于休眠状态的B细胞，继而促进B细胞的增殖和分化，IL-4还对IgG合成起着重要的作用。能增加IgE介导的体液免疫和杀伤细胞的杀伤能力。研究发现，它能够抑制人类单核细胞IL-1B、TNF-α、IL-6细胞因子的分泌，降低B细胞中CD-5的表达，促进人类T细胞的生长。

由于IL-4具有多种生物学功能，其临床适应症较广。IL-4可用于某些肿瘤的治疗；在某些炎症或自身免疫病中有治疗价值，如应用于关节炎的治疗；IL-4还可能成为防治糖尿病的药物。目前国外应用重组IL-4治疗肿瘤已进入I期和II期临床试验。

白细胞介素-4是分子量大约从15kD到19kD的糖蛋白。IL-4前体分子由153个氨基酸组成，其中第1～24个为信号肽序列。成熟的人IL-4分子由129个氨基酸残基组成，理论相对分子量为15000。有两个可能的糖基化位点，经过不同的N糖基化可得到18-19KD，甚至60KD。成熟肽的氨基酸序列中共有6个Cys，分别位于成熟肽氨基酸序列的第3、24、46、65、99、127位，含有3对分子内二硫键(3-127，24-65，46-99)，二硫键对IL-4的活性是必需的。

IL-4的构型以α螺旋为主(9～21，45～64，74～96，113～129)。IL-4对多种蛋白酶敏感，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶和V8蛋白酶。IL-4在4℃中可保存3个月以上，在室温中可保存1个月，56℃10min不被灭活。在pH2～10中保持稳定。

已有的研究表明，糖基对IL-4的生物活性似乎没有影响，大肠杆菌表达的IL-4具有与哺乳动物细胞中表达的产物相当的生物活性。大肠杆菌生产重组蛋白具有容易操作、生长迅速和培养基要求简单等优势。国内外对IL-4的表达和纯化工作已有报道，但是表达量不高，一般占菌体总蛋白的5-10％，而且以包涵体形式表达，包涵体变复性后，目的蛋白损失很大，以致IL-4最终得率很低。

因此，迫切需要开发新的高效生产重组人IL-4的方法，本发明采用了大肠杆菌表达系统表达IL-4，通过对人IL-4基因的优化，构建含有优化的人IL-4基因的表达载体，并获得了高水平的表达菌株；通过控制发酵条件，达到了较高蛋白表达率；在此基础上对包涵体表达的rhIL-4的纯化进行了大量的摸索和研究后，得到了高纯度、高得率、可供动物实验的rhIL-4蛋白。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产重组人白细胞介素-4的方法。

本发明的另一目的就是提供优化的重组人白细胞介素-4的编码序列和用于该方法的表达载体及工程菌株。

在本发明的第一方面，就是提供了一种优化的编码重组白细胞介素-4的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有区别。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，含有权利要求1所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达载体是pET30a(+)/IL-4。

在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。

在另一优选例中，所述的工程细胞是大肠杆菌BL21(DE3)，是多个蛋白酶的基因缺陷菌株，基因型为hsdSgal(λcIts857 ind1Sam7nim5lacUV5-T7基因)，非常适合外源基因的高效表达。

在本发明的第四方面，提供了一种生产重组人白细胞介素-4的方法，该方法包括步骤：