[发明专利]甲醇酵母生产人激肽释放酶－1

权利要求书

1.一种由甲醇酵母(Pichiapastoris)系统高效分泌表达，并经过发酵、纯化过程制备且含有糖基化修饰的重组人激肽释放酶-1(r-hK₁)。

2.根据权利要求1中的高效分泌表达，是指上罐发酵时所获得的发酵上清中r-hK₁的蛋白产量可达到1.2g/L。

3.根据权利要求1所制备的r-hK₁的分子量范围是28～32kDa，整个分子是一条含有238氨基酸残基的多肽链，其N-端前15个氨基酸残基为I-V-G-G-W-E-C-E-Q-H-S-Q-P-W-Q-，C-末端3个氨基酸残基为-E-N-S，分子内全部为甲醇酵母的N-型糖链修饰，其中糖类占整个糖蛋白的8.86～17.16％，蛋白的等电点(pI)约为4.0。r-hK₁的基因及氨基酸序列分别为SEQ-1和SEQ-2。

4.根据权利要求1中所制备的r-hK₁，采用S-2266发色底物法确定的比活性为5.2 PNAU/mg。

5.根据权利要求1中所指的发酵是采用全盐培养基，甲醇诱导表达r-hK₁时的pH6.2，温度为30℃，诱导时间50小时。

6.根据权利要求1中所指的纯化是由疏水层析(Phenyl-SepharoseFF)捕获、阴离子交换层析(Q-SepharoseFF)除去杂蛋白并浓缩目的蛋白r-hK₁，以及凝胶过滤层析(Superdex-75)分段收集获得高纯度r-hK₁这三步层析纯化过程组成。其中Phenyl-Sepharose FF疏水层析的最适上样条件是20mM PB，1.0M(NH₄)₂SO₄，pH6.0，最适洗脱条件是20mM PB，pH6.0，Q-Sepharose FF阴离子交换层析的上样电导率不高于8.0mS/cm。

7.根据权利要求1中所制备的r-hK₁可以显著降低大鼠脑梗塞动物模型的死亡率。