[发明专利]一种平行的多位点基因型实时定量检测技术

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及核酸检测、基因诊断、基因序列分析、基因类型及多态性的分析以及基因表达的分析等领域。更具体地说，本发明涉及多位点基因突变检测多个位点碱基多态性分析，其中这些位点可以是在不同的基因片段上。

背景技术

在基因检测或是核酸序列分析中，通常要检测少到一个基因位点的突变或是单个碱基多态性变化。核酸连接酶反应包括连接酶检测反应(Ligase Detection Reaction，LDR)和连接酶链反应(Ligase Chain Reaction，LCR)就是为此目的而设计的。它可以单独使用或结合聚合酶链式反应(PCR)快速准确地检测少到一个碱基的变化。

核酸连接酶反应是Landegren等人于1988年为检出序列中点突变而设计、发明的。合成一对探针A、B，它们完全覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后，探针A、B间留下一个切口，加入连接酶封闭切口，两探针成靶序列完整的互补链。如果靶序列中有点突变，探针不能与靶序列精确结合，切口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后探针仍是两个。显然，当靶序列中存在点突变时，检测连接产物结果是阴性的。

Barany于1991年报道了耐热连接酶-Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用，为连接酶反应的实用化奠定了基础。用Taq连接酶做连接酶反应只在两个保温点的循环(94℃、1min和65℃、3min)。产物检测也非常方便、敏感。因此可以说连接酶反应是目前检测已知序列中有无点突变和单碱基多态性检测的最佳方法。

连接酶检测反应是通过设计两条能与靶序列DNA精确并且紧密杂交的寡核苷酸探针(本发明中也称为连接酶反应探针、或是分别称为区分探针和通用探针)完成的。寡核酸杂交后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而在连接点有错配的相邻碱基则几乎不发生共价连接，连接产物通常是通过凝胶电泳观察其大小，或通过核酸杂交技术检测。这一过程如重复进行多个循环，则连接产物会呈线性增加(图1)。若此反应中有两对互补的与能靶序列DNA结合的寡核苷酸探针(本发明中也称为连接酶反应探针、或是分别称为区分探针和通用探针)进行循环的连接反应，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中当模板，则靶序列以指数形式扩增出来，或称之为连接酶链反应(图2)。

核酸连接酶反应除单独使用外，还可结合聚合酶链式反应，进一步提高其检测的灵敏度。可以在连接酶反应的一对寡核苷酸探针的两端加上一对引物序列，连接酶检测反应的产物再通过PCR反应进一步扩增(图3)。或是PCR扩增后，以PCR反应产物为靶序列DNA，通过连接酶检测反应检测PCR产物上的单碱基差异(图4)。

用于连接酶反应的寡核苷酸探针一般为20个左右碱基，使被检变异核苷酸位于即将连接的两个寡核苷酸探针连接点端。例如在图1-图4中第2步反应位于右侧寡核苷酸探针的5’端。同时，左侧寡核苷酸探针是5’荧光标记。右侧寡核苷酸5’端需磷酸化才能与左侧寡核苷酸的3’-OH相连接。当两段寡核苷酸探针与靶序列DNA紧密杂交上后，且在连接点无错配碱基时，DNA连接酶将两段寡核苷酸探针共价连接。如果某一寡核苷酸探针与靶序列DNA杂交不上，或是杂交上后连接点存在错配碱基，则DNA连接酶不能将两段寡核苷酸探针共价连接。

因此，连接酶反应对于单个碱基的差异极为敏感，它通常用于单个碱基位点的突变检测，或是单碱基多态性的分析。而且，连接酶链反应的扩增效率与PCR相当。同时，连接酶检测反应亦可以有多对寡核苷酸探针，而且多对寡核苷酸探针可以不局限于在靶DNA链的一段区域中。多个连接产物可通过与DNA阵列杂交的方法同时检测。所以，连接酶检测反应与DNA阵列技术相结合可同时检测多个位点的碱基差异。

但是，连接酶反应和检测是一多步反应，反应后需要烦琐的DNA电泳检测或是核酸杂交检测，因此检测步骤多、时间长，并且由此容易产生样品相互之间的交叉污染。使得连接酶反应对技术操作人员以及实验室要求很高，而且检测的错误率很高。连接酶反应最终在临床检测的应用受到了挑战。

因此，本领域中仍然需要有操作更为简单的平行检测多种核酸分子的点突变或基因多态性的方法。

发明内容

本发明者经过技术创新和深入研究，建立了能同时对核酸中多位点的基因型进行实时检测定量分析的方法。

具体而言，本发明第一方面提供了一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供一样品，所述样品中包含待检测的核酸分子；

b)对所述核酸分子进行核酸连接酶反应，得到经荧光基团标记的连接产物；