[发明专利]酶联免疫体外诊断试剂中酶结合物溶液的制备

说明书

技术领域：

本发明属于生物体外诊断试剂技术领域。具体涉及一种酶联免疫体外诊断试剂中酶结合物溶液的制备。

背景技术：

1971年Engvall和Perlmann首次报道建立了酶联免疫吸附检测法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，已被广泛应用于抗原、抗体、细胞因子以及生化物质等的检测。该方法的基本原理是：把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫学活性。将抗体或抗原与酶通过化学方法交联成酶结合物，酶结合物既有抗体或抗原的免疫学活性又有酶的催化活性。检测时，先把受检标本与固相载体上的抗原或抗体反应，洗涤，去掉未反应的物质，然后加入酶结合物进行反应，洗涤，再加入底物溶液及显色剂反应，生成有色产物，最后加终止液终止反应。有色产物的吸光度(OD值)与受检标本中的抗原或抗体量直接相关，从而可以根据OD值进行定性或定量分析。

ELISA试剂的具体检测方法很多，各种方法都不可缺少酶结合物。酶结合物在ELISA试剂中非常关键，其灵敏度、显色背景和稳定性对试剂质量至关重要。高灵敏度、低显色背景和良好的稳定性是高品质ELISA试剂所要达到的基本要求。酶结合物的灵敏度在很大程度上是由其自身的性质决定的，但酶结合物所用稀释液(酶稀释液)对其灵敏度有一定的影响，酶稀释液的良好与否还对酶结合物的稳定性和显色背景有非常明显影响。因此，制备性能良好的酶稀释液是ELISA试剂生产中的重要环节。

常见的酶稀释液一般使用缓冲系统(如PBS)、小牛血清(或牛血清白蛋白等)、防腐剂及表面活性剂等制备而成。但用该稀释液制备的工作浓度酶结合物稳定性较差，有效期很短。为了保持酶结合物的稳定，传统的酶联免疫体外诊断试剂中的酶结合物是以浓缩液的形式储存的，当使用时用酶稀释液作一定倍数稀释，现配现用，一般在2～8℃保存不超过一周。这样，用户使用比较麻烦，而且往往由于稀释误差造成实验结果不准确。

如何提高酶联免疫体外诊断试剂中的酶结合物的稳定性，又能方便检验人员的使用，是众多诊断试剂制造商长期以来努力解决的问题。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，通过改进酶联免疫体外诊断试剂中的酶稀释液来提高酶结合物的稳定性，同时降低显色背景，提高检测灵敏度。

本发明通过改变酶联免疫体外诊断试剂中的酶稀释液的成分来提高酶结合物的稳定性，使酶结合物能够以工作浓度提供给用户，方便用户使用，同时降低显色背景，提高检测灵敏度。

本发明提供了一种酶联免疫体外诊断试剂中酶结合物的制备方法。

本发明改变了传统酶稀释液的组成成分，选择了一种合适的酶保护剂一苦杏仁酸，加入到酶稀释液中，显著提高了酶结合物的稳定性。将原来常用的防腐剂硫柳汞钠换成了Proclin 300(或者Proclin 950)，后者的防腐性能明显优于前者，降低了酶稀释液被微生物污染的风险，可以防止酶结合物因微生物污染而导致显色异常降低或背景异常升高。将原来的表面活性剂吐温20(Tween 20)换成了曲拉通X-100(Triton X-100)，明显降低了显色背景。在酶稀释液中加入了小牛血清，小牛血清是良好的蛋白保护剂，同时也减少了非特异性吸附。加入酚红溶液，用以指示酶稀释液的PH值在正常范围。

制备酶结合物时，将浓缩酶结合物以所需的比例(如1∶100～1∶5000)加入到上述酶稀释液中即可。新配方的酶稀释液显著提高了酶结合物的稳定性，酶结合物能够以工作浓度提供给用户，在试剂盒保存条件下(2～8℃)一年内保持稳定。用户可以直接使用不必临时稀释，同时降低了显色背景，提高了检测灵敏度。

本发明的酶联免疫体外诊断试剂中酶结合物的制备方法包括下列步骤：

(1)配制0.05-0.2M PBS或0.01-0.2M Tris-HCl缓冲液，pH值为6.5～7.4；

(2)在该缓冲系统中加入苦杏仁酸，终浓度为0.2g/L～1.2g/L，搅拌，使充分溶解；

(3)加入Proclin 300或Proclin 950，终浓度为0.2g/L～1.2g/L，搅拌，使充分溶解；

(4)加入Triton X-100，终浓度为0.1ml/L～1.0ml/L，搅拌，使充分溶解；

(5)加入酚红1％无水乙醇溶液，终浓度为2ml/L～10ml/L，搅拌，使充分溶解；

(6)加入小牛血清，终浓度为200ml/L～400mlg/L，搅拌，使充分溶解；