[发明专利]一种高通量筛选能分泌有活性脂肪酶的工程菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体的，本发明涉及一种筛选脂肪酶生产菌的方法。

背景技术

微生物脂酶和脂肪酶近年来倍受关注，因为它们在食品加工、表面活性剂、造纸、石油、诊断、制药等诸多方面都有很高的应用价值。然而有些有价值的脂肪酶对热不稳定，如在25℃以上活力会骤降。因此构建能大量表达脂肪酶的工程菌、或从脂肪酶文库中高通量筛选活性高或稳定性强的脂肪酶具有重要意义。

在表达脂肪酶的酵母工程菌筛选方面，目前的筛选方法是将转化获得的酵母菌落首先转移至BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，100mM磷酸钾缓冲液，PH6.0，1.34％YNB，1.5％琼脂)平板，30℃培养过夜后，这些克隆点种于BMMY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，0.5％甲醇，100mM磷酸钾缓冲液，PH6.0，1.34％YNB，1.5％琼脂，并补以2％橄榄油，0.0002％罗丹明B)平板，30℃培养2-3天后，能分泌有活性的脂肪酶的菌落周围会出现有罗丹明指示剂的圈。但是这种方法的缺点是不能确定分泌高温下稳定的脂肪酶的重组克隆，这是由于作为脂肪酶的底物的橄榄油需要直接配制在培养基中，其在菌体表达脂肪酶的同时被分解；而在经历高温后再在培养基上涂抹橄榄油则无法达到敏感、精确的筛选要求，甚至无法在短时间显示指示圈。

因此，随着脂肪酶被越来越多地被应用在各个领域中以及对其使用要求的提高，在脂肪酶生产菌筛选方面迫切需要一种方便、灵敏的筛选方法，更特别的，需要一种筛选高温下稳定的脂肪酶的工程菌的方法，为脂肪酶筛选提供新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选脂肪酶生产菌的方法，更特别的，为一种筛选能够表达有活性的且高温下稳定的脂肪酶的工程菌的方法。

在本发明的第一方面，提供一种筛选表达脂肪酶的菌株的方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)在培养基上培养脂肪酶基因表达菌，所述的脂肪酶表达菌中转化有含脂肪酶基因表达盒的表达载体，使所述的脂肪酶表达菌表达脂肪酶；和

(2)将对硝基苯酚脂肪酸酯施加于培养基上，观察培养基上的菌落颜色，菌落颜色变黄的为可表达脂肪酶的菌株。

在本发明的一个优选例中，所述的培养基为固体培养基，其在凝固前的pH值为7.5-9.0(优选的为7.5-8.5，更优选的为7.8-8.0)。

在本发明的另一优选例中，所述的培养基为MM固体培养基，并且其中含有PH7.5-9.0的磷酸盐缓冲液。

在本发明的另一优选例中，所述的对硝基苯酚脂肪酸酯选自下细：碳链长为C2-C18的脂肪酸的对硝基苯酚酯的一种或几种。优选的，所述的对硝基苯酚脂肪酸酯选自碳链长为C2-C18的脂肪酸的对硝基苯酚酯的一种或几种。

在本发明的另一优选例中，所述的所述的碳链具有10、12、14、16或18个碳原子。

在本发明的另一优选例中，在步骤(1)和(2)之间，还包括步骤：将生长有所述的表达菌的培养基在40-75℃的温度下放置0.5-6小时，从而在之后的步骤中获得表达高温下稳定的脂肪酶的菌株。

在本发明的另一优选例中，在所述温度下放置1-5小时；更优选的，放置1.5-4小时；比如3小时。

在本发明的另一优选例中，所述的表达菌选自：酵母、细菌。更优选的，所述的表达菌为酵母。

在本发明的另一优选例中，所述的酵母表达菌包括但不限于：Pichiapastoris KM71、或Pichia pastoris X33。

在本发明的另一优选例中，所述的表达载体为酵母表达载体。

更优选的，所述的酵母表达载体为含有AOX1启动子的载体；更优选的，所述的酵母表达载体包括但不限于：pPIC9K，或pPICZα。

在本发明的另一优选例中，用无水甲醇诱导表达菌表达脂肪酶；更优选的，诱导时间约为2天。

在本发明的另一优选例中，所述的步骤包括：

(a)将克隆有脂肪酶基因的酵母表达载体转化到酵母表达菌中，在MD固体培养基上培养所述的酵母表达菌，26-31℃(更优选的为27-30℃；最优选的为28-30℃)培养至长出菌落；

(b)将MD固体培养基上的酵母表达菌转接于BMGY固体培养基，26-31℃(更优选的为27-30℃；最优选的为28-30℃)培养24-48小时(如48小时)；