[发明专利]检测高危型人乳头瘤病毒的方法及试剂盒

说明书

所属领域

本发明涉及检测临床样品中人乳头瘤病毒(HR-HPV)存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时定量荧光聚合酶链反应技术检测临床样品中高危型人乳头瘤病毒，以为诊断宫颈癌、尖锐湿疣提供实验室依据的临床检测方法及完成该方法所使用的试剂盒。

发明背景

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年，随着生活方式的改变，宫颈癌患者的发病年龄更趋年轻化，并且病例数有不断上升的趋势。宫颈癌是目前唯一一种发病原因比较清楚的的肿瘤，主要病因是由高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续或反复感染所致[Walboomers JM，Jacobs MV，Manos MM，et al.Humanpapillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide.J Pathol，1999；189(1)：50-53]。目前确定的HPV型别约有80个，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，其中约35个型别涉及生殖道感染。依据不同型别HPV与宫颈癌发生危险性的高低，又分为低危险型HPV和高危型HPV，约20个型别与肿瘤相关。在世界范围内，宫颈癌主要危害那些未进行高危型人乳头瘤病毒筛查的妇女。

研究表明，HPV16、18型与宫颈癌高度相关，31、33和35型中度相关。HPV型别分布有地域差别，在中国人群中，HPV16、52、58型相对多见。HPV的阴性预测价值达100％，即无HPV感染时可基本排除宫颈癌的发生。宫颈癌早期手术治疗效果极佳，以预防为主的策略作为降低宫颈癌死亡率的主要途径是简单而有效的[Nobbenhuis MAE，Walboomers JMM，Helmerhorst TJM，et al.Relation of humanpapillomavirus status to cervical lesions and consequences forcervical-cancer screening：a prospective study.Lancet，1999；354：20-25]。如果能早期检查出并成功地治疗(特别是癌前干预性治疗)发生在宫颈组织的癌前病变(可以潜伏多年)，就可有效地阻断癌前病变向宫颈癌的发展。

人乳头瘤病毒感染病例的诊断主要依靠实验室检查。实验室检查包括细胞形态学检测和分子生物学检测(测序、原位杂交、杂交捕获、PCR等)。细胞形态学检测方法灵敏度与特异性均较低，受操作者的主观影响比较大；测序、原位杂交技术复杂，对操作者的要求较高，在临床应用中受到限制；杂交捕获方法已被美国FDA批准并已应用于临床，但该方法成本高、操作复杂、存在假阳性，因此也限制了其在宫颈癌普查中的大规模应用；定性PCR方法虽然灵敏度高并能对病毒进行早期检测，但是因其步骤繁琐且容易造成污染，从而也限制了它的临床使用。

实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的(终点检测)PCR技术相比，实时定量检测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。实时荧光PCR技术是在聚合酶链反应(PCR)体系中加入荧光标记探针，使用一种带有电荷偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。通过对扩增曲线以及循环阈值(Ct)的分析，能够对被检样品进行定性和定量分析。