[发明专利]抗癌作用的林蛙卵蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于抗癌药物和保健品及其制备领域，特别涉及一种林蛙卵抗癌蛋白药物及其制备方法。

背景技术

林蛙(Rana chensinensis)是我国东北地区长白山麓药、食两用的珍贵蛙种。林蛙蛙卵具有很高的营养价值，可应用于制药和保健食品，具有调节免疫、延缓衰老、壮阳、明目、调节血脂和预防妇女更年期综合症的作用。在民间被公认是与林蛙输卵管即林蛙油、蛤士蟆油、田鸡油并列的滋补佳品。目前，国内很多学者和企业已经对林蛙蛙卵的卵油进行了研究开发和利用，主要是采用CO₂超临界萃取技术等方法提取其中脂溶性的林蛙卵油，发现林蛙卵油中的不饱和脂肪酸种类和含量都十分丰富，其中不饱和脂肪酸含量为76.36％，饱和脂肪酸含量为23.64％，主要不饱和脂肪酸均为十六碳烯酸、油酸、亚油酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十碳四烯酸、二十碳烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)。此外，中国林蛙卵油中还含有雌二醇以及维生素A、D、E等。对林蛙卵油的一些生物活性研究结果表明，林蛙卵油可以拮抗四氯化碳对肝脏的毒性，提高小鼠红细胞中SOD的抗氧化活性，具有中枢神经抑制作用，进而起到抗惊厥和保护惊厥动物的作用。

申报林蛙研究的专利也逐年增多，以林蛙和卵为关键词，检索国内外专利，没有查到国外关于林蛙的专利，国内31篇。其中CN1287837“林蛙卵及其应用”是保护林蛙卵在调节免疫、延缓衰老、壮阳、明目、调节血脂和预防更年期方面的作用；CN1670192“中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法”、CN1546497“林蛙卵卵磷脂分离提纯方法”、CN1389552“活体林蛙的取油方法”、CN1346639“一种林蛙雌蛙成体输卵管全质营养液的制作方法”、CN1212140“促钙吸收作用的林蛙卵组合物及其制剂”等只是涉及保护林蛙卵卵磷脂的提取方法和林蛙油，即林蛙输卵管的应用；此外CN1370559“抗衰老降血脂营养保健软胶囊及其制法”等10余篇专利都是关于保护林蛙卵油的萃取技术、林蛙卵油降血脂、抗焦虑作用产品的生产技术。没有检索到林蛙蛙卵抗癌活性蛋白的研究和专利。

本发明从林蛙卵中提取的具有抗癌活性的蛋白提取物，经Sephadex G-100和DEAE-cellulose柱层析分离得到林蛙蛙卵抗癌活性蛋白。并将得到的产品用于体内和体外的抗癌作用研究，结果显示林蛙卵蛋白对S₁₈₀胃肉瘤、白血病K562细胞和HL60细胞有明显的抑制生长作用，其抑制率达到50％以上；并能诱导K562肿瘤细胞发生凋亡，细胞膜破损、细胞变形或出现胞芽和缢痕，细胞皱缩变小，胞浆致密，核固缩，染色质浓集、边聚化，胞质空泡化等，其S期DNA含量低于G₁期。据此，本发明研究了林蛙卵抗癌活性蛋白的制备方法并进行了抗癌实验效果观察。

发明内容

本发明的目的是从林蛙蛙卵中提取具有抗癌活性的蛋白质，并进行体内和体外抗癌实验，使林蛙卵蛋白制成具有抗癌活性的药物或保健品。

本发明涉及的林蛙卵抗癌活性蛋白以林蛙卵为原料，其制备方法如下：

1.将林蛙蛙卵加入2-8倍体积的10mM pH6.5的磷酸钠缓冲液，于4000-8000rpm条件下常温匀浆；

2.上述匀浆液在3000-8000rpm下，4-20℃离心10-60min，吸取脂肪层与沉淀之间的上清液，冷冻干燥；

3.将上述冻干粉溶于蒸馏水中配成溶液；

4.上述溶液经Sephadex G-100凝胶柱层析，收集活性组分；

5.活性组分透析脱盐，冻干浓缩；

6.冻干粉溶于蒸馏水中配成溶液，经DEAE-cellulose柱层析，收集活性组分；

7.活性组分透析脱盐，冻干，于-20℃保存，得到本发明的林蛙卵抗癌活性蛋白。

附图说明

图1是本发明的SephadexG100的凝胶层析图；

图2是本发明的DEAE-cellulose柱层析图。

图3(1)对照组K562细胞 (2)丝裂霉素 (3)林蛙蛙卵抗癌活性蛋白

图4中国林蛙蛙卵抗癌活性蛋白作用不同时间对K562细胞的抑制作用图

具体实施例

下面实施例进一步说明本发明的制备方法，并不是用来限制发明的范围。

实施例1：

1.取鲜林蛙蛙卵100g加入10mM pH6.5的磷酸钠缓冲液200ml，于8000rpm条件下常温匀浆；