[发明专利]一种植物超氧化物歧化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶的制备方法，尤其涉及一种植物超氧化物岐化酶的制备方法，属于生物化学工程技术领域。

背景技术

超氧化物岐化酶(superoxide，dismutase，简称：SOD)是一种金属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生岐化反应，消除超氧阴离子自由基所引起的生物大分子过氧化等细胞损伤，具有消炎祛病，保健美容的功效。目前SOD已广泛被应用于医药、保健品、食品和日化等许多行业中。

现有的SOD制备主要以三种原料为主，第一，以动物体组织或血为来源，第二，以微生物为原料来源，第三，以植物为原料来源。一般以动物体组织或血为原料制备的SOD存在着价格较贵，体内半衰期短的缺点，再者，现在疯牛病及禽流感的大范围出现，原料的质量及安全性受到置疑，微生物主要利用其发酵来生物合成，由于微生物易受环境因素的影响，所得SOD其回收率及活性得不到保证，由于这方面国内研究时间较短，未建立其相对应完善统一的质量标准，难以监控产品质量。在《成都航空职业技术学院学报》的2005年3月第1期中由金绍黑发表了《植物超氧化物岐化酶的提取、修饰制备工艺剂其应用研究》的文章，该文章公开了热变性沉淀法及盐析和金属鳌合亲和层析法来制备和提纯超氧化物岐化酶，上述这些方法对原料中的病毒及有害细菌没有有效的措施加以抑制，制得SOD活性不高，且工艺中设备投入成本大，不适合大规模工业化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种卫生、适合规模工业化生产的植物超氧化物岐化酶的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种植物超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将洗净的豆粕、龙葵、白英、筋骨草、蛇莓分别粉碎、打浆；

(2)合并步骤(1)中的打浆后的产物，添加重量3～4倍于合并后产物、质量百分比为0.5～2％的碱离子液，厌氧发酵1～12个月；

(3)发酵完后，添加饱和缓冲液，直至pH值为7～8，厌氧静置4～6小时；

(4)添加氧化剂和萃取剂到发酵容器中，脱水沉淀，过滤，取滤液，添加脱水氧化剂，在-10～0℃下，厌氧真空冷冻1～4小时，上述氧化剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的1～100％，上述萃取剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的15～80％，上述脱水氧化剂添加的量为步骤(3)中溶液体积的15～80％；

(5)沉淀得到粗品酶，采用80～400目滤布抽滤，接着离心分离，取沉淀物，于-30～0℃真空冷冻干燥8～72小时；

(6)将重量40～60倍于步骤(5)中产物、质量百分比为10～15％的还原糖培养基添加到上述产物，再添加重量0.2～0.3倍于还原糖培养基、质量百分比为1.5～3％的掩蔽剂，在78～90℃条件下温浴，温浴产物温度至65～75℃，取出；

(7)在10～20分钟内，冷却至16～20℃，采用400～600目滤布抽滤；

(8)取滤液，添加脱水氧化剂，厌氧静置2～4小时，抽滤、离心分离，得到产物，于-30～0℃真空机冷冻干燥24～72小时，再经常温真空器干燥24～72小时，即得超氧化物岐化酶，上述脱水氧化剂添加的量为步骤(7)中抽滤后溶液体积的15～80％，

其中步骤(1)中各原料之间的质量比为1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100。

进一步提高所得酶的质量及活性，所述步骤(1)中的原料还包括白花蛇舌草和半枝莲，且各物质之间的质量比为1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100。

进一步提高所得酶的质量及活性，所述步骤(1)中的原料还包括鸭跖草、葎草和鱼腥草，且各物质之间的质量比为1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100。