[发明专利]人LPL基因突变体抗动脉粥样硬化

说明书

技术领域：

本发明为不易感动脉粥样硬化动物树鼩LPL cDNA及具有较高生物活性的人LPL突变体的获得，涉及生物医学高技术中新基因、新蛋白质的开发与应用领域。

发明背景：

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是严重危害人类健康的常见疾病之一，也是缺血性心脑疾病的重要病理基础。无论是在人体内发生的还是用高脂高胆固醇饮食诱导实验动物产生的AS，均与血浆脂质和脂蛋白的异常有密切关系，因此，脂质代谢紊乱是AS形成的一个重要危险因素。

脂蛋白脂防酶(lipoprotein lipase，LPL)是水解乳糜微粒(Chylomicron，CM)和极低密度脂蛋白(verylow density lipoprotein，VLDL)中甘油三酯(triglyceride，TG)的关键酶，其主要作用是分解CM和VLDL中的TG，并在脂蛋白之间转移胆固醇，磷脂和载脂蛋白，代谢产物游离脂肪酸为组织提供能量，或再酯化为TG，储存在脂肪组织中，代谢后的VLDL转化为中间密度脂蛋白(immediate density lipoprotein，IDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)，分解后的CM表面脂质脱落，形成新生的HDL，因此LPL在清除体内富含TG的脂蛋白和形成HDL的过程中起关键作用。

1987年Wilson等成功克隆并测定了人LPL的cDNA序列，并推导出其蛋白的一级结构。人的LPL基因大约35Kb，定位于8P22，其cDNA全长约3.5Kb。研究表明LPL基因含有10个外显子，9个内含子；外显子1编码5’非翻译区，外显子10编码3’非翻译区，外显子10远比其它外显子大。人LPL核苷酸编码475个氨基酸残基，其中包含27个氨基酸的信号肽序列及448个氨基酸残基的成熟多肽。已知哺乳类动物的LPL氨基酸序列的同源性很高，超过90％，鸟类与哺乳类相比，同源性大约在70％左右。

树鼩(Tree shrew，TS)是分布在我国云南等地的一种低级灵长目的食虫动物。八十年代初，我们发现树鼩血浆中具有高水平的HDL，平均占血浆总脂蛋白的70％-75％，血浆中总胆固醇的水平接近于人(158mg/dl)。当喂饲树鼩高脂高胆固醇饮食18--32周后，它们体内血浆总胆固醇浓度虽然升高，但HDL-C比例增高，而LDL-C在总胆固醇中的比例下降，病理检查其主动脉等部位无明显AS病变形成。因此，树鼩被认为具有特殊脂质代谢机制的不易感动脉粥样硬化动物，但树鼩不易感动脉粥样硬化的机制目前尚不十分了解，为深入探讨该动物不易感动脉粥样硬化的原因，我们课题组目前已经成功克隆了树鼩下列几种与脂蛋白代谢相关的基因，如APOAI、APOCI、APOE、APOCII、PLTP、LCAT、APOAV和CETP等，初步分析了它们的结构特点，并与人以及其它动物的相同基因进行了比较。但目前为止，尚未有对树鼩LPL基因相关的报道。

发明目的：

克隆树鼩LPL基因，推导出其相应的蛋白质氨基酸序列，比较人与树鼩LPL活性；。同时根据树鼩LPL的序列特点及与人LPL的差异，对人LPL序列的相应氨基酸处进行定点突变，比较野生型LPL与突变体活性的差异，从而为动脉粥样硬化等疾病的基因诊断和基因治疗以及新药筛选提供可能的理论指导和依据。

内容与要求：

应用RNA提取与纯化技术、Smart-race PCR技术、分子克隆、DNA序列测定技术、分子生物学软件、Real-time PCR技术、蛋白质的表达与纯化技术、抗血清制备、DNA定点突变技术、细胞培养技术、Westernblot技术、放射性同位素法测定LPL活性等技术方法首次获得编码树鼩LPL的cDNA全长，应用Real-timePCR技术分析树鼩LPL的组织特异性分布，纯化原核表达的目标蛋白质并免疫家兔制备抗血清，应用定点突变技术获得人LPL的四个突变体，应用放射性同位素方法分别对野生型人及树鼩LPL，人LPL的突变体进行功能的分析比较。

该基因/蛋白达到的技术指标为：

1.树鼩LPL cDNA序列全长为3295bp，其中开放阅读框架1437bp，5’端非翻译区129bp，3’端非翻译区1729bp。序列中出现的第一个ATG的+4位碱基为G，符合真核基因转录起始的要求，可以作为有效起始密码子。该cDNA的终止密码子为TGA，距3’末端poly(A)加尾信号AATAAA的下游23bp处为由16个腺苷酸组成的poly(A)尾，表明该序列为一个完整的cDNA。