[发明专利]vasostatin－荧光素酶的融合蛋白及其制法和用途

权利要求书

1.一种融合蛋白，其特征在于，它包括：

(1)血管生成抑制因子vasostatin，该因子来源于人钙网蛋白N端1-180位氨基酸，蛋白大小为20千道尔顿(kDa)；

(2)生物发光显像报告基因——萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，以下简称fluc)，该荧光素酶来源于北美萤火虫，已经进行了修饰以适合在哺乳动物细胞中表达，蛋白大小为65千道尔顿(kDa)；以及

(3)位于治疗基因vasostatin与fluc报告基因之间的四种不同长度的柔性短肽，其氨基酸序列为(GGGGS)n。

2.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的融合蛋白。

3.一种真核表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA分子，是pcDNA3.1(+)/Vaso-FLuc重组体。

4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的表达载体。

5.如权利要求4所述的宿主菌，其特征在于，该宿主菌是大肠杆菌。

6.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核哺乳动物细胞293ET或PC3前列腺癌细胞。

7.一种活性测定方法，其特征在于，将融合蛋白转染权利要求6所述的宿主细胞，测定融合蛋白荧光素酶的生物学活性。

8.一种蛋白检测方法，其特征在于，将融合蛋白转染权利要求6所述的宿主细胞293ET，48小时后收集细胞裂解液，将细胞裂解液作十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳，用羊抗钙网蛋白N端抗体和抗FLuc抗体作为一抗，用免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。

9.一种稳定表达权利要求1所述的融合蛋白的宿主细胞，其特征在于，它包括步骤：在合适表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞PC3前列腺癌细胞，用G418进行筛选和分离，从而稳定表达所述的融合蛋白。

10.对权利要求9所述的细胞进行的体外生物发光显像，其特征在于，它包括步骤：将权利要求9所述的细胞按倍比稀释的方式(100,000-196个细胞)接种于96孔板，等到90％满度时，每孔加入荧光素至终浓度为150μg/ml，37℃、5％CO2孵箱中孵育7～10分钟，将96孔板置于成像暗箱中显像1分钟，用Xenogen公司的IVIS显像系统进行图像获取及分析。