[发明专利]vasostatin－荧光素酶的融合蛋白及其制法和用途

说明书

技术领域：

本发明属于基因表达显像领域。具体地说，本发明涉及一种治疗基因-血管生成抑制因子vasostatin和生物发光显像报告基因-萤火虫荧光素酶(以下简称fluc)的融合蛋白，该融合表达载体的构建，涉及用双荧光素酶报告系统筛选出荧光素酶活性最佳的融合蛋白，涉及用生物发光显像技术进行体外显像进一步了解融合蛋白的活性。

背景技术：

血管生成是指从已存在的血管系统生成新的血管的过程。很多研究表明实体瘤的发生、发展以及转移都与血管生成密切相关。利用血管生成抑制剂进行的肿瘤抗血管生成治疗为实体瘤的治疗提供了新的策略。一些血管生成抑制剂如endostatin、angiostatin、TNP-470等已被发现并被应用于研究肿瘤的治疗。Vasostatin是1998年Pike等从Epstein-Barr病毒永生化细胞株的培养上清液中分离纯化出的一种血管生成抑制因子，经鉴定证实为多功能蛋白质钙网蛋白的N端1-180位氨基酸。Vasostatin在体外可抑制内皮细胞如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖；在裸鼠肿瘤形成试验中，vasostatin可明显减低人Burkitt淋巴瘤、人结肠癌和胰腺癌的生长，延长带Meth A和LL/2c肿瘤小鼠的存活时间。

近些年来，基因治疗特别是肿瘤基因治疗发展很快。对转染基因的定位和表达进行监测，基因显像是最有效的方法。一些非侵入性的活体成像技术，如PET、SPECT MRI、超声、CT、生物发光显像和荧光显像可用于活体动物进行基因表达显像。其中，生物发光显像(Bioluminescence imaging，BLI)是利用荧光素酶，在ATP、氧气的辅助下，与外源注入的特异底物荧光素反应产生荧光，使用高度灵敏的CCD相机可观测并纪录发出的光子，进行显像。

将报告基因与所感兴趣的治疗基因偶联，通过对报告基因显像可以间接监测治疗基因的表达。这一策略需要报告基因与治疗基因能成比例且恒定的表达。治疗基因与报告基因偶联的方案包括：融合表达方案、双顺反子方案、双启动子方案、双载体方案、双向转录方案等。本发明采用融合表达方案，将治疗基因(vasostatin)和报告基因(fluc)偶联构建融合表达载体，通过生物发光显像技术对报告基因fluc显像来监测治疗基因vasostatin的抗肿瘤生成作用。最终建立一种灵敏的方法，通过对报告基因显像来监测治疗基因在活体动物体内的位置、活性以及持续时间，为肿瘤基因治疗提供一个优异方法。

发明内容：

本发明的一个目的就是提供一种新的具有治疗基因vasostatin和生物发光报告基因fluc两者生物活性的融合蛋白。

本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供一种用生物发光显像技术在体外对融合蛋白的荧光素酶活性检测的方法。

1.本发明克隆了血管生成抑制因子vasostatin基因，该因子来源于人钙网蛋白N端1-180位氨基酸；克隆了生物发光显像报告基因——萤火虫荧光素酶基因fluc，该荧光素酶来源于北美萤火虫，已经进行了修饰以适合在哺乳动物细胞中表达；同时将上述治疗基因vasostatin与报告基因fluc串联。为使表达的融合蛋白中两个蛋白互相不干扰，并有天然的特性，在治疗基因vasostatin和报告基因fluc之间加入了四种不同长度的柔性短肽，其氨基酸序列为(GGGGS)n。

2.本发明在293ET和PC3细胞中测定了四种融合重组质粒荧光素酶的活性。其中，含柔性肽段(GGGGS)2的融合表达重组质粒(v₁₀fl)荧光素酶活性最佳。

3.本发明用免疫印迹法检测了融合蛋白的表达情况。

3.本发明用G418筛选和分离了稳定表达V₁₀FL融合蛋白和阳性对照Fluc的PC3细胞。

4.本发明应用生物发光显像技术进行了体外显像。阳性对照FLuc能检测到的最少细胞数为300～700/孔，而V₁₀FL融合蛋白为1500～3000/孔。两种稳定细胞系中，每孔发出的光子数与细胞数的相关性均很好。