[发明专利]埃博霉素B的制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体的说，涉及埃博霉素B的制备方法、制剂工艺及其制备治疗格列卫耐药的慢性髓细胞性白血病药物的用途。

背景技术

埃博霉素为上个世纪八十年代末GBF的微生物学家发现的粘细菌纤维堆囊菌SorangiumCellulosum产生的次级代谢产物。1987年分离出两种新的大环内酯物命名为埃博霉素A和B，实验发现对培养的真菌病原体有抑制活性。1994年美国国家癌症学会发现埃博霉素B对肿瘤细胞具有抑制活性，Merck实验室发现它和紫杉醇至少在微管蛋白聚合实验中有相同作用，证明了埃博霉素对肿瘤细胞有抑制作用的事实。

进一步研究发现，埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性。①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化。②埃博霉素没有紫杉醇细胞内毒素活性。③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒性。④在Richard等研究的紫杉醇敏感的人类细胞系中，埃博霉素B比埃博霉素A和紫杉醇具有更大的抗增殖活性，而埃博霉素A往往比紫杉醇的活性更低。另外，埃博霉素对一株多药耐药性直肠癌系和紫杉醇抗性卵巢癌系仍然具有敏感性。目前埃博霉素有几种同类物质已经进入临床研究阶段。主要包括Epothilone B(EPO B)，Epothilone D及BMS-247550。在对300个病人的初步临床实验中，该化合物对结肠癌、乳腺癌、肾脏和卵巢癌，有确切的疗效。

R₁＝Me  R₂＝H    epothilone A

R₁＝Me  R₂＝Me   epothilone B

目前公开发表的通过发酵制备埃博霉素B方法生产成本高，尚需研究大规模和简单廉价的发酵制备技术和分离纯化方法。

慢性髓细胞性白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是血液系统最常见的恶性疾病之一，在国内年发病率约为0.36/10万，占白血病的第三位。CML的分子生物学特征是存在bcr/abl融合基因，该基因通过转录翻译产生分子量为210KDa的融合蛋白P₂₁₀^bcr/abl，该融合蛋白具有异常增高的酪氨酸激酶活性，使造血干细胞发生异常转化而导致CML发生。K562细胞系来源于急变期CML病人，P₂₁₀^bcr/abl呈阳性，是研究CML经典的细胞模型。

目前治疗CML的前线化学药物是2001年新上市的格列卫(Glivec，或称STI571)^[1]。属于α-苯胺嘧啶衍生物，格列卫作用的机理是作用ATP与酪氨酸激酶结合位点，特异性抑制ABL酪氨酸激酶。虽然应用格列卫能够使急变期CML完全缓解，但大部分病人对格列卫的应答期较短，最终细胞对其耐药而使临床复发(2)。CML细胞对格列卫的耐药机理比较复杂。由于格列卫上市不久的新药，目前还没有很好的方法克服CML对其耐药性。目前人们对CML治疗研究是尝试延缓或阻止CML细胞对格列卫产生耐药性，其中通过筛选发现与格列卫不同结构、不同作用机制的活性化合物，克服细胞对格列卫的耐药性，或与格列卫合并使用克服细胞的耐药性，成为CML治疗研究的一个重要方向。

发明内容

本发明提供了一种大规模发酵生产埃博霉素B的方法。

具体的说，本发明方法包括如下步骤：

(a).种子液在发酵罐发酵培养12～96小时，加入1％～10％吸附剂，吸附代谢产物

(b).发酵100-150小时后停止发酵，稠布过滤发酵液收获吸附剂

(c).吸附剂用异丙醇提取后减压浓缩或用水浸润，再用乙酸乙脂萃取旋转蒸发至干，得含埃博霉素B粗提物

(d).提取物使用低级醇溶解后，先经过常压柱层析用低级醇与氯代烷的混合液或单用低级醇洗脱

(e).HPLC检测并合并含埃博霉素B的馏份，减压浓缩到一定体积后，通过液相色谱进一步纯化，得到纯化的埃博霉素B。

步骤a中的种子液可由冻存菌种逐级放大培养后再转入培养基中培养1～5天得到，菌种可为商业菌种如纤维堆囊菌ATCC 15384号经紫外或诱变剂诱变菌种，或为土壤中分离得到的其他纤维堆囊菌种。

吸附剂优选弱极性大孔吸附树脂，如AB-8、DA201等。