[发明专利]瓜类细菌性果实腐斑病免疫磁珠及制备方法

说明书

一、技术领域

本发明属于一种用于检测由燕麦嗜酸菌西瓜亚种病菌引起的瓜类细菌性果实腐斑病，即BFB的特异试剂及其制备方法，尤其是一种瓜类细菌性果实腐斑病免疫磁珠及制备方法。

二、背景技术

燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)，简称Aac，可以引起瓜类细菌性果实腐斑病(Bacterial fruit blotch of cucurbits)，简称BFB，这种细菌属于世界性检疫有害生物，而尤其引起的上述病害是我国公布的《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》中规定的三类危险性病害。

瓜类细菌性果实腐斑病目前发病地区有日益扩大的趋势。该病苗期症状常表现为大的黑色病斑而无任何水浸状，这使田间诊断变的很困难，病原细菌的分离培养诊断需要10～14d，程序繁琐。瓜类种子细菌性果实腐斑病带菌率大于0.1％时，就可能给生产带来较大损失。但如此低的带菌率，给检测增加了很大的难度，如用99％的准确度确保种子批号的带菌率在0.1％以下，每个批号需抽取50000粒种子检测，这就是检测费用高的原因之一。研制出适合我国实际的种子带菌检测技术，是防止该病在我国蔓延的有效措施之一。

目前检测瓜类种子细菌性果实腐斑病的方法有：

(1)幼苗检测。即在温室条件下，创造适合瓜类细菌性果实腐斑病的发病条件，即温度在27～30℃之间，湿度在85％以上，一般需要4～5周后才可检测出种子细菌性果实腐斑病的带菌率。这种方法是传统的病菌检测方法，是国际种子协会认可的检测方法，能反映在实际情况下可能的发病情况，但条件较难控制，费时，占地大，费用高。根据我国制种批次小，分散的具体实情，这种检测方法很难推广应用。

(2)保湿生长盒检测法。即在透光的塑料盒中装入蛭石和珍珠岩，然后将种子散播其上，密封后放入25℃，日光灯人工生长室中，大约两周后即可检测出病苗。这种方法的优点是条件控制准确，占地小，易于规范化操作，准确性较高；缺点是有时会受苗期其它病害如瘁倒病的干扰。

(3)利用半选择性培养基。将种子发芽后保湿保温，然后将幼苗匀浆液在半选择培养基上进行选择培养，找出细菌性果实腐斑病菌菌落，将其纯化后再根据病菌的生理生化和病理特征确认。也可从种子中分离获得，可先将种皮和种胚分离后分别置于pH7.1的磷酸缓冲液中培养过夜，然后划线分离，以确定种子是内部带菌还是外部带菌。对病叶、病果，取新鲜病健交界处病斑，用KB培养基就能够分离得到。瓜类细菌性果实腐斑病菌在该培养基上37℃培养2d可见菌落，3d后，菌落圆形，直径1～2mm，3～4d后，菌落继续扩大，形成一个橄榄绿中心的环形，而多数其它种传细菌菌落蓝色菌落更小。

(4)血清学检测方法。近年趋向于利用荧光抗体法和酶联吸附法。荧光抗体法(fluorescent antibody technique)是将荧光染料与抗体以化学方法结合起来形成标记抗体。抗体与荧光染料结合不影响抗体的特性，标记的荧光抗体与相应的抗原结合后，受荧光显微镜高压汞灯光源的紫外光照射，便激发出荧光，荧光的存在就表示抗原的存在。酶联免疫吸附法，enzyme linked immunosorbent assay简称ELISA，是继免疫荧光技术和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫标记技术。有直接法、间接法、双抗夹心法及竞争法。ELISA具有选择性好、灵敏度高、结果判断客观准确、实用性强的优点而广泛应用于生物和医学领域。ELISA技术对大量样品的检测尤其适合。血清学技术最主要的缺点是受抗血清质量和专化性的限制。多克隆抗体制备简单，但通常和近缘细菌有交叉反应，饱和吸附虽然可以消除部分交叉反应，但常以降低效价为代价；单克隆抗体虽然专化性好，但一般只能检测一个或几个血清型的细菌，制备过程复杂，技术和设备要求较高。