[发明专利]获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素或胰岛素衍生物的方法

权利要求书

1.一种从胰岛素或胰岛素衍生物的前体获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素或胰岛素衍生物的方法，所述前体在半胱氨酸或盐酸半胱氨酸和离液助剂的存在下经历一个折叠过程，在该折叠过程之后，通过如下方式从所述前体获得胰岛素或胰岛素衍生物：采用胰蛋白酶或类胰蛋白酶并且任选另外采用羧肽酶B进行酶裂解，接着在吸附树脂上进行纯化；该方法包括依次实施以下步骤以完成所述折叠过程：

(a)将胰岛素或胰岛素衍生物的前体的水悬浮液与一定量的半胱氨酸或盐酸半胱氨酸混合，该量导致1～15个半胱氨酸或盐酸半胱氨酸的SH残基/前体的半胱氨酸残基；

(b)在pH值约8～约11.5、温度约15～约55℃下，将含半胱氨酸或盐酸半胱氨酸的前体悬浮液加入到浓度为4～9M的离液助剂溶液中，使所得混合物在所述温度下保持约10～60分钟；和

(c)在pH值约8～约11.5、温度约5～约30℃下，将混合物加入到一定量的水中，使得混合物中半胱氨酸或盐酸半胱氨酸的浓度稀释到大约1～5mM，离液助剂的浓度稀释到0.2～1.0M。

2.如权利要求1所要求的方法，其中

在步骤(a)中，半胱氨酸或盐酸半胱氨酸的量相当于导致1～6个半胱氨酸或盐酸半胱氨酸的SH残基/前体的半胱氨酸残基的量；

在步骤(b)中，在pH值8～11、温度30～45℃下，将含半胱氨酸或盐酸半胱氨酸的前体悬浮液加入到浓度为4～9M的离液助剂溶液中，使所得混合物在所述温度下保持20～40分钟；而且

在步骤(c)中，在pH值8～11、温度15～20℃下，将混合物加入到一定量的水中，使得混合物中半胱氨酸或盐酸半胱氨酸的浓度稀释到大约1～5mM，离液助剂的浓度稀释到0.2～1.0M。

3.如权利要求1或2所要求的方法，其中所说的离液助剂为胍或盐酸胍。

4.如权利要求1或2所要求的方法，其中所说的离液助剂为尿素。

5.如权利要求1～4中的一个或多个权利要求所要求的方法，其中步骤(b)中的离液助剂浓度为7.0～9M。

6.如权利要求1～5中的一个或多个权利要求所要求的方法，其中步骤(b)中的温度为40℃。

7.如权利要求1～6中的一个或多个权利要求所要求的方法，其中步骤(b)中的pH值为10～11。

8.如权利要求1～7中的一个或多个权利要求所要求的方法，其中步骤(c)中的pH值为10～11。

9.如权利要求1～8中的一个或多个权利要求所要求的方法，其中步骤(c)中水的量使得混合物中半胱氨酸或盐酸半胱氨酸的浓度稀释到2.5～3mM，离液助剂的浓度稀释到0.5M。

10.如权利要求2～9中的一个或多个权利要求所要求的方法，其中步骤(b)中的离液助剂浓度为8M，步骤(b)中的温度为40℃，步骤(b)中的pH值为10.6，步骤(c)中的pH值为10.6，步骤(c)中水的量使得混合物中半胱氨酸或盐酸半胱氨酸的浓度稀释到2.5～3mM，离液助剂的浓度稀释到0.5M。