[发明专利]获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素或胰岛素衍生物的方法

说明书

本申请是申请日为1998年8月17日、申请号为03152330.7、发明名称为“获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素或胰岛素衍生物的方法”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种在半胱氨酸或盐酸半胱氨酸和一种离液助剂存在下，获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素或胰岛素衍生物的前体的改进的方法。本发明还涉及一种由上述前体获得胰岛素或胰岛素衍生物的方法。

背景技术

人胰岛素蛋白具有两条氨基酸链，总共具有51个氨基酸残基。两条氨基酸链中含有6个半胱氨酸残基，每两个半胱氨酸残基通过二硫键彼此连接。具有生物活性的人胰岛素，其A和B两条链间通过两个胱氨酸键进行连接，且A链中含有另一个胱氨酸键。从统计学角度看，人胰岛素分子中的二硫键形成方式具有15种可能性。然而，只有一种二硫键形成方式的人胰岛素具有生物活性。人胰岛素分子中下列半胱氨酸残基彼此连接：

A6-A11

A7-B7

A20-B19

字母A和B分别代表胰岛素的两条氨基酸链，数字代表氨基酸残基的位置，分别从每条链的氨基端到羧基端数起。两个人胰岛素分子间也可以形成二硫键，因此很容易形成许多不同的二硫键。

已知可从人胰岛素原制备人胰岛素的方法。人胰岛素原是有一条具有86个氨基酸残基的线性氨基酸链的蛋白，人胰岛素的B和A两条链是通过具有35个氨基酸残基的C肽彼此连接的。人胰岛素中二硫键是通过一个中间物-人胰岛素中的半胱氨酸残基形成的，该半胱氨酸带有硫保护基团，如S-磺酸根(-S-SO₃^-)基团(EP 0037255)。另外，已有方法可以制备具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素原(Biochemistry，60，(1968)，p622-629)，该方法是从猪胰腺中制备的胰岛素原开始，其中半胱氨酸残基是以SH残基形式存在的。“正确键合的胱氨酸键”这一术语指的是具有生物活性的哺乳动物胰岛素中发现的二硫键。

DNA重组技术能够使胰岛素或胰岛素衍生物的前体，尤其能够使人胰岛素原或者氨基酸序列和/或氨基酸链长度区别于人胰岛素的胰岛素原在微生物中制备。由基因修饰大肠杆菌细胞制备的胰岛素原不具有正确键合的胱氨酸键。下面是利用大肠杆菌(EP 0055945)制备人胰岛素的方法步骤：

微生物发酵-细胞破碎-融合蛋白的分离-卤化氰裂解融合蛋白-含有胰岛素原序列的裂解产物的分离-S-磺酸基对胰岛素原中胱氨酸残基的保护-S-磺酸基的色谱提纯-正确键合的胱氨酸键的形成-胰岛素原的脱盐-含有正确键合的胱氨酸键的胰岛素原的色谱提纯-胰岛素原溶液的浓缩-胰岛素原浓缩溶液的色谱提纯-酶裂解胰岛素原以获得人胰岛素-所获得的人胰岛素的色谱提纯。

该方法的不足之处为步骤较多且在每一提纯步骤中都有产物损失，结果胰岛素的产率很低。由于操作多步骤，造成大量产物的损失。从以卤化氰裂解融合蛋白到亚硫酸盐化(sulfitolysis)和胰岛素原的提纯，预计损失40％的胰岛素原(EP 0055945)。在以后获取终产物的纯化过程中，同样会有很大的损失。

如果能大大简化操作步骤，通过DNA重组技术制备人胰岛素或其衍生物的产率将会得到提高。

EP 0600372A1(或US 5,473,049)和EP 0668292A2公开了一种制备胰岛素或胰岛素衍生物的改进方法，在该方法中，在有硫醇，如半胱氨酸，以及至少一种离液助剂，如尿素或盐酸胍的情况下，使胰岛素或胰岛素衍生物的前体发生反应，结果使胰岛素或胰岛素衍生物的前体中非正确键合的胱氨酸键转变为正确键合的胱氨酸键。在已知方法中，这些蛋白首先以很低浓度溶解在含有一种离液助剂或多种离液助剂的混合物的水溶液中，然后，再将蛋白混合物与硫醇水溶液进行混合。

发明内容

惊奇的是，发现胰岛素或胰岛素衍生物的正确折叠的前体的产率可以通过以下方法提高并且还可以减少折叠反应所需要的时间，首先将硫醇，即半胱氨酸或盐酸半胱氨酸加到前体的水悬浮液中，而不是在第一步中将前体借助离液助剂加入溶液中；然后加入离液助剂水溶液使前体发生溶解；最后用适量的水稀释混合物，使其中的半胱氨酸或盐酸半胱氨酸的浓度达到一个优选的浓度，从而使得前体发生正确的折叠反应。

因此，本发明涉及一种在半胱氨酸或盐酸半胱氨酸和离液助剂存在下，获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素或胰岛素衍生物的前体的改进的方法，该方法包括依次实施以下步骤：