[发明专利]包含疟原虫MSP－1的C－末端片段的重组蛋白

说明书

本发明涉及新的来自感染哺乳动物尤其是人的疟原虫裂殖子形式中的主要表面蛋白的疫苗活性成分，一般称为MSP-1。

MSP-1已成为许多研究的主题。它在疟原虫类寄生虫尤其是恶生疟原虫的裂殖体阶段合成，并在疟原虫的肝阶段和细胞阶段(1，2，3，4)以裂殖子的一种主要表面成分的形式表达。因为该蛋白的显著特征并且在所有已知的疟原虫属的种类中保守，因此推测它可能是构建抗疟原虫疫苗(5、6)的一个候选物。

该蛋白的片段尤其是被观察到在例如寄生虫进入被感染宿主的红细胞的侵入期间形成的天然裂解产物也是如此。这样的裂解产物有分子量为42kDa的C-末端片段的(7、8)，其本身再次被裂解为具有通常表观分子量为33kDa的N-末端片段和具有通常表观分子量为19kDa的C-末端片段(9)，后者在借助于糖基磷脂酰肌醇(GPI)基团进行修饰后，通常仍保持固定在寄生虫膜上(10，11)。

还在红细胞内发育周期的早期阶段发现该片段(15，16)，从而作出这样的观察结论，即19kDa片段可起到仍然未知，但毫无疑问在再侵入过程中为必需的作用，这构成了过去形成的该蛋白可构成疫苗的尤其有效的耙标的假设基础。

应理解下面经常提及的来自疟原虫属的一些种类的p42和p19蛋白是指相应的该疟原虫的MSP-1蛋白的C-末端裂解产物，或广义地说指通过基因重组，或通过使用常规技术，如使用“AppliedSystem”合成仪的化学合成，或通过“Merrifield”型固相合成而获得的包含基本上相同的氨基酸序列的产物。为了方便，所提到的“重组p42”和“重组p19”指通过包含至少一个基因工程步骤的方法而获得的“p42”和“p19”。

面对获得大量恶性疟原虫寄生虫的困难以及不可能体外培养间日疟原虫，很清楚生产抗疟原虫疫苗的唯一方法是求助于使用重组蛋白或肽的方法。然而，由于其具有200kDa的很大的大小，生产全部MSP-1非常困难。这引导研究者研究其C-末端部分，它的(仍然未知的)作用可能更为重要。

已制备出并在猴中测试过的涉及恶性疟原虫MSP-1的C-末端部分的重组蛋白(12，40，41)为：

·大肠杆菌(40)中产生的与谷胱甘肽-S-转移酶融合的p19；

·大肠杆菌(12)中产生的与谷胱甘肽-S-转移酶融合的p40；

·与来自破伤风类毒素的多肽融合的并带有在酿酒酵母中产生的辅助T细胞表位的p19(12)；

·在杆状病毒系统中产生的p42(41)。

包含大肠杆菌中产生的与谷胱甘肽-S-转移酶融合的p19蛋白，并混合有明矾或脂质体的组合物在六个接种的Aotus nancymal猴中没有一个显示出保护性效果(40)。

包含大肠杆菌中产生的与谷胱甘肽-S-转移酶融合的p42蛋白，并混合有弗氏完全佐剂的组合物当给予两类Aotus猴(A.nancymai和A.vociferans)时没有显示出保护性效果。酿酒酵母中产生的p19蛋白在两个A.nancymai种类的Aotus猴中显示出保护性效果(12)。而在两个A.vociferans种类的Aotus猴中没有保护性效果。

一些研究者(Chang等)还报导了在兔中使用在杆状病毒系统中产生的含有恶性疟原虫(18)中共有的氨基酸序列的重组p42蛋白进行的免疫试验。后边这些作者指出在兔中重组p42基本上以与完整重组MSP-1蛋白(gp195)相同的方式起作用。该p42蛋白结合弗氏完全佐剂已成为在易被恶性疟原虫感染的非人灵长类Aotus、狐猴(lemurinus grisemembra)中进行的疫苗接种试验中的主题(40)。结果表明3个动物中的2个被完全保护，第三个虽然显示出与对照类似的寄生虫血症，但是具有较长的潜伏期。然而推出如此诱导的抗寄生虫本身的抗体的保护性是冒险的。应该记住目前对于间日疟原虫和恶性疟原虫，在灵长类中没有非常满意的实验模型。对于恶性疟原虫和间日疟原虫开发出的松鼠猴模型，对恶性疟原虫开发的Aotus模型，是需要寄生虫种类适应并通常需要切除动物的脾以获得显著的寄生虫血症的人工系统。结果，来自该模型的疫苗接种对于人类仅具有有限的预测价值。

无论如何，用该重组蛋白可能获得的实际接种比例为多少仍是一个问题，记住下面报导的发现，即在来自疟原虫属相同种类的p42，尤其是在相应的p33中在许多情况下存在高可变区，这使得在用来自疟原虫属种类的p42接种的个体中所诱导的抗体抗相同种类其它个体感染的免疫保护性功效不确定(13)。

甚至可假设p42的N-末端部分的高多态性在通常观察到的对这类寄生虫的免疫逃避中起着明显的作用。