[发明专利]p53表达产物在制备治疗肿瘤药剂中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及p53表达产物在制备治疗肿瘤药剂中的应用。

背景技术

肿瘤疾病现已上升为世界第2号″杀手″，其死亡人数仅次于心血管病。几年来，国内外医学界对于肿瘤疾病的发病机理在细胞基础上又有了新的认识。基于对肿瘤发病机制的进一步理解，人们利用各种途径来研制和开发能够特异，有效地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的药物。  目前，对于癌症的治疗仍以化疗及放疗为首选，两者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效，但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性因而具有较大的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上限制了它们在临床中的应用。近年来，为了开发出能特异性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒负作用的药物，人们对癌症的发病机制从细胞，分子水平上的研究予以高度重视和巨额投资。

抑癌基因p53的编码产物是一种转录调控因子可通过调节下游的靶基因来诱导细胞凋亡或细胞周期阻滞进而抑制肿瘤细胞在体外，体内的生长，因而被认为是一个肿瘤基因治疗的新点。

减毒鼠伤寒沙门氏菌被证实它不仅可以特异地在肿瘤细胞中高度集聚增殖并抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长，同时也可作为工程菌运输载体来表达外源基因且具有良好的肿瘤细胞靶向性，因而，减毒伤寒沙门氏菌介导的肿瘤基因治疗将会为癌症的治疗开辟一条新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供p53表达产物在制备治疗肿瘤药剂中的应用，包括介导的肿瘤靶向基因治疗技术。

本发明提供了p53多肽在制备治疗肿瘤药剂中的应用，所述的治疗肿瘤药剂为肿瘤靶向基因治疗药物。主要是基于减毒鼠伤寒沙门氏菌可以特异地在肿瘤细胞中高度集聚增殖并可作为工程菌运输载体来表达p53基因，所以通过口服给药后，减毒鼠伤寒沙门氏菌可由肠道通过不同途径到达肿瘤部位进而持续表达p53，从而提高药物的肿瘤靶向性和效率。

本发明中，p53多肽编码序列是从人肾cDNA表达文库筛选得到，cDNA序列的长度为1182bp，利用基因工程技术表达该蛋白，相应的多肽分子量为53KD。

在本发明中，术语“p53基因开放阅读框序列”包括p53基因或者其简并序列的开放阅读框序列(其全长核苷酸序列见NCBI NM000546)。该简并序列是指，p53基因序列(开放阅读框)中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与p53基因序列的ORF核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出p53蛋白的序列。该术语还包括其表达产物具有抗肿瘤活性并且其序列具有如p53基因序列的核苷酸分子的变异形式。这些变异形式不影响其表达产物的抗肿瘤活性，包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

本发明的p53可通过调节下游的靶基因来诱导细胞凋亡或细胞周期阻滞进而抑制肿瘤细胞在体外，体内的生长。

本发明中，将p53克隆入真核载体中然后转染人结肠癌(HCT116)及人肺癌细胞(H1299)，48小时后收集细胞，流式细胞仪检测结果提示p53过度表达可以较好的诱导细胞凋亡。    

本发明用Western blot和PCR的方法来检测减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的p53在肿瘤细胞中的表达，结果提示与空白对照菌株比较，p53可在肿瘤细胞中表达，其蛋白产物为53KD。表达p53的减毒鼠伤寒沙门氏菌感染人肿瘤细胞后，可诱导明显的肿瘤细胞凋亡；随着感染时间的增加，更多的肿瘤细胞发生凋亡。本发明的p53可以用于诱导人结肠癌细胞、人胰腺癌细胞、肝癌细胞、人宫颈癌细胞、人非小细胞肺癌细胞、骨肉瘤细胞、人急性T淋巴细胞性白血病细胞和人急性早幼粒白血病细胞等肿瘤细胞的凋亡。

表达p53的减毒鼠伤寒沙门氏菌可以抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长：用表达p53的减毒鼠伤寒沙门氏菌经口服喂食荷瘤小鼠，与空白对照菌株比较，可以明显地抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长荷瘤小鼠的生长周期。

本发明p53多肽、p53基因及其类似物等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。