[发明专利]固定化双酶法制备N－乙酰神经氨酸

说明书

技术领域

本发明涉及用利用酶促反应制备N-乙酰神经氨酸的方法，尤其涉及利用固定化酶的方法制备N-乙酰神经氨酸。

背景技术

在生物体神经氨酸生物代谢途径中，N-乙酰葡萄糖胺异构化产生N-乙酰甘露糖胺，由N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸通过N-乙酰神经氨酸醛缩酶的催化反应就可以生成神经氨酸。神经氨酸及其衍生物通过转糖基反应结合到生物体表面发挥其生物学效力。唾液酸(N-乙酰神经氨酸及其衍生物)在细胞信号传导和相互识别过程之中起着十分重要的作用，例如在流感病毒感染宿主细胞的过程之中，流感病毒的唾液酸酶可以识别N-乙酰神经氨酸及其衍生物，并通过与唾液酸结合感染细胞并释放出复制好的病毒。如果将其唾液酸酶进行抑制，那么就可以治疗病毒导致的疾病。根据唾液酸的结构，设计其类似物，利用这种类似物结合病毒的唾液酸酶，使之失去与宿主细胞表面唾液酸结合的机会，那么病毒就可以被有效地抑制。如葛兰素公司推出的抗病毒新药zanamavir就是N-乙酰神经氨酸的类似物，它具有良好的抗病毒活性。

工业上生产N-乙酰神经氨酸主要分为化学合成法、天然产物水解法、微生物发酵法和酶法合成，其中酶法合成相对于前几种方法，具有高效、专-、快速的优点，因此受到人们的重视。N-乙酰神经氨酸的酶法合成主要以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸为底物，在N-乙酰神经氨酸醛缩酶的催化下生成N-乙酰神经氨酸。

使用酶法生产N-乙酰神经氨酸始于上世纪60年代，Comb等人首次使用N-乙酰神经氨酸醛缩酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸。

1985年，Ohta，Y等人从E.coli中克隆出N-乙酰神经氨酸醛缩酶，揭开了借助基因工程手段生产N-乙酰神经氨酸的序幕。

由于N-乙酰甘露糖胺价格昂贵，人们-直在探索利用较为廉价的N-乙酰葡萄糖胺来生产N-乙酰神经氨酸。

1964年Ghost从猪肾脏中提取出了N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶，由于该酶提取困难，所以不能用于工业化大规模生产。1991年，Kragl等人使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和丙酮酸通过连续反应生产N-乙酰神经氨酸，但是N-乙酰葡萄糖胺的转化率仅为18％，而且从猪肾中直接提取的异构酶量十分少，不能满足大规模生产的要求。

1996年，I Maru等人从猪肾中成功克隆出了N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶，并且发现他与肾素结合蛋白有很高的同源性(99％)，由于该酶的成功克隆，使得酶法生产N-乙酰神经氨酸的工业化应用成为可能。1997年，I Maru等人利用克隆表达的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和神经氨酸醛缩酶大规模反应生产N-乙酰神经氨酸，他们通过补加丙酮酸的方法，将84％的N-乙酰葡萄糖胺转化为77％的N-乙酰神经氨酸和7％的N-乙酰甘露糖胺。之后，人们相继发现人，鼠的肾素结合蛋白具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶活力，2003年，Jeong-OhLee等人利用人肾素结合蛋白和神经氨酸醛缩酶在同一反应器中转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生产N-乙酰神经氨酸，他们采用先高温异构反应，再低温转化为N-乙酰神经氨酸的方法，转化率可达到60％左右。

人们通过碱性条件或使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶使廉价的N-乙酰葡萄糖胺转化为N-乙酰甘露糖胺。使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶两酶在同一反应器中共转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸可以克服碱性条件异构反应引起的底物丙酮酸或其盐降解，N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活力下降等问题。但两酶共转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸的生产中，使用的酶均为游离态的酶，其缺点在于酶不能重复使用，且反应的时间较长(约240小时)。

因此，本领域迫切需要提供一种新的使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶在同一反应器中共转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸的方法，该方法不仅转化率高，同时N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶可以重复使用，而且所用的反应时间短。

发明内容

本发明旨在提供一种使用固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶制备N-乙酰神经氨酸的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种制备N-乙酰神经氨酸的方法，它包括步骤：

(a)将N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸或其盐与0.6-10U/ml固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和1.2-10U/ml固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶混合得到反应混合物；

(b)从反应混合物中分离得到N-乙酰神经氨酸。