[发明专利]一种农杆菌介导的番茄外植体高效转化系统

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及农杆菌介导的番茄外植体转化系统。

背景技术

农杆菌介导法是应用最广泛的植物转基因方法，具有转化效率高、外源插入片段明确、单拷贝整合等优点。已经有多种基因通过农杆菌转化法转移到多种植物当中的报道，获得的转基因植物可具有抗病毒、抗真菌、抗虫、抗除草剂、抗旱、改善品质等优良性状。

番茄是重要的农作物，也有大量的转基因研究的报道。吴昌银等(《植物学报》2000，42(7)：719-723)报道把雪花莲外源凝集素基因(GNA)通过农杆菌导入番茄，获得具有抗蚜虫性状的转基因番茄；张赛群等(《园艺学报》1999，26(6))报道把异戊烯基转移酶(Isopentenyl transferase，ipt)基因通过农杆菌导入番茄，得到能抑制叶片衰老的转基因番茄；欧阳波等，(Journal of Plant Physiology and Molecular Biology2003，29(3)：179-184)报道将双价水解酶基因通过农杆菌系统转入番茄，获得对枯萎病抗性的提高的转基因番茄。

黄瓜花叶病毒病(CMV)是一种非常严重的病毒病害。黄瓜花叶病毒(CMV)能侵染烟草、蕃茄等许多种植物，属于黄瓜病病毒群(cucumovirus group)，是以黄瓜、番茄为主的多种作物病毒病的主要病原体，广泛分布于世界各地，寄主范围极广，危害很大。

通过农杆菌介导的转基因方法，将黄瓜花叶病毒病的经改造的外壳蛋白、运动蛋白等基因导入到番茄中，例如，转入体外培养的番茄外植体中，再经诱导分化，形成带有目的基因的再生植株，是获得对黄瓜花叶病毒病具有抗性的番茄品种的重要途径。农杆菌是否能有效地感染番茄外植体并获得完整的转基因植株，受许多因素的影响，如番茄品种、质粒的大小、农杆菌侵染的方法、外植体的生理状态、培养基、诱导剂选择等等。以往的番茄外植体转化系统不够理想，主要体现在：(1)番茄经农杆菌感染后出愈率(形成愈伤组织并形成再生芽的比率)低；(2)转化率(最后获得的转基因苗的比率)低。因此，本领域迫切需要高效的农杆菌介导的番茄外植体转化系统，为开发稳定、优异的抗黄瓜花叶病毒转基因番茄新品种服务。

发明内容

本发明的目的之一是供一种高效的农杆菌介导的番茄外植体转化系统，克服现有的番茄外植体转化系统转化效率低的不足。

本发明的另一目的是提供一种农杆菌介导的番茄外植体转化方法，用于培育转基因番茄品种。

提本发明通过以下技术方案实现：

选择适当的番茄品种，用该番茄品种的种子培育成无菌苗，选择该无菌苗的不同部位作为外植体培养；采用带有目的基因的农杆菌感染该外植体，感染后用选择培养基培养，转化的外植体形成愈伤组织、再生芽，未转化的外植体则被淘汰；再生芽经过生根培养，可形成完整的转基因植株。

本发明的第一方面，提供一种番茄外植体转化系统，包括以下部分：

(1)用于制备外植体的沪番1479号番茄品种的种子；

(2)带有包含目的基因的质粒的根癌农杆菌；

(3)培养基。

所说的外植体为番茄品种沪番1479种子长成的无菌苗的子叶、下胚轴；优选沪番1479无菌苗的子叶。

所说的农杆菌选自包含双元载体系统的根癌农杆菌的一种，优选根癌农杆菌EHA105；载体选自微型Ti质粒中的一种，优选微型Ti质粒pBIN19；目的基因为黄瓜花叶病毒运动蛋白缺陷基因(CMV-dMP)k130片段。

所说的培养基包括：作为基础培养基的MS培养基，在MS培养基中加入ZT2.0mg/L、IAA0.2mg/L的预培养培养基，在MS培养基中加入ZT2.0mg/L、IAA0.2mg/L、选择性抗生素的愈伤诱导选择培养基，在MS培养基中加入IAA0.1mg/L、选择性抗生素的生根培养基。

选择性抗生素的种类、浓度根据质粒中抗性基因种类确定。在一个优选的方案中，所说的质粒为微型Ti质粒，带有卡那霉素抗性基因；所说的选择性抗生素包括50-100mg/L的卡那霉素。

本发明的第二方面，公开了一种农杆菌介导的番茄外植体转化方法，包括如下步骤：