[发明专利]检测乙型肝炎病毒前C/BCP区基因突变的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种使用反向斑点杂交技术检测HBV基因前C区及BCP区突变的方法，该方法包括：(1)分离提取待检样品中的靶DNA分子；(2)利用小分子标记引物并进行聚合酶链反应扩增靶DNA片段；(3)使特异性寡核甘酸探针与靶核酸在适当的基质上杂交；(4)检测杂交结合物并借以判断靶DNA的突变类型。本发明的特征在于聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别是：5’-AGGCATACTTCAAAGACTG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GCTCCAAATTCTTTATAAG-3’(SEQ ID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：

探针1：NH2-5’-AGGTTAAAGGTCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：3)

探针2：NH2-5’-AGGTTAATGATCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：4)

探针3：NH2-5’-GCTTTGACACATGGA-3’(SEQ ID NO：5)

探针4：NH2-5’-TGGCTTTGGGGCATG-3(SEQ ID NO：6)

探针5：NH2-5’-TGGCTTTGGGACATGG-3’(SEQ ID NO：7)

探针6：NH2-5’-TGCAACTTTTTCACC-3’(SEQ ID NO：8)

探针7：NH2-5’-GGCTTTAGGGCATGG-3’(SEQ ID NO：9)

探针8：NH2-5’-GCTTTAGGACATGGA-3’(SEQ ID NO：10)

探针9：生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH₂(SEQ ID NO：11)。

2.根据权利要求1的方法，其中所说的靶DNA样品是得自被检者血液中HBV基因组DNA样品。

3.根据权利要求1的方法，所说的检测是使用带有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置，恒温水浴、空气浴装置完成的。

4.根据权利要求1的方法，其中所说的小分子标记物选自生物素。

5.根据权利要求1的方法，其中所说的基质选自尼龙膜、硝酸纤维素膜。

6.根据权利要求1的方法，其中所说的DNA突变类型包括HBV基因组前C区/BCP区的不同类型的点突变，分别是核心启动子区核甘酸nt1762A/nt1764G和nt1762T/nt1764A双突变，以及前C区nt1896G/nt1896A和nt1899G/nt1899A双突变。

7.用于检测乙肝病毒前C区及BCP区突变的试剂盒，该试剂盒包括：(1)DNA抽提试剂；(2)聚合酶链反应试剂；(3)杂交反应试剂，特征在于聚合酶链反应扩增体系中的所使用的正向和反向引物分别是：5’-AGGCATACTTCAAAGACTG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GCTCCAAATTCTTTATAAG-3’(SEQ ID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：

探针1：NH2-5’-AGGTTAAAGGTCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：3)

探针2：NH2-5’-AGGTTAATGATCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：4)

探针3：NH2-5’-GCTTTGACACATGGA-3’(SEQ ID NO：5)

探针4：NH2-5’-TGGCTTTGGGGCATG-3(SEQ ID NO：6)

探针5：NH2-5’-TGGCTTTGGGACATGG-3’(SEQ ID NO：7)

探针6：NH2-5’-TGCAACTTTTTCACC-3’(SEQ ID NO：8)

探针7：NH2-5’-GGCTTTAGGGCATGG-3’(SEQ ID NO：9)

探针8：NH2-5’-GCTTTAGGACATGGA-3’(SEQ ID NO：10)

探针9：生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH₂(SEQ ID NO：11)。

8.根据权利要求7的试剂盒，其中所说的DNA抽提试剂是用3％～10％聚乙二醇和1mol/L的氯化钠配制而成的浓缩液和DNA提取液组成。