[发明专利]检测乙型肝炎病毒前C/BCP区基因突变的方法和试剂盒

说明书

所属领域

本发明涉及检测临床血液样品中乙肝病毒(HBV)基因组前C区及核心启动子区域(BCP)突变的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测HBV基因前C/BCP区突变的方法及所使用的试剂盒。

发明背景

乙型肝炎病毒(HBV)是严重危害人类健康的世界性传染疾病，全世界上大约有20亿人感染过HBV，其中慢性HBV感染患者至少有3.8亿。慢性乙型肝炎病毒感染的自然病程漫长，持续慢性感染可导致急、慢性肝炎、肝硬化甚至原发性肝癌(Funk M，Rosenberg D，LokA.Worldwide epidemiology of HBeAg-negative chronic hepatitis B and associated precore and core promotervariants.J Viral Hepatitis，2002，9：52-61.)。

乙型肝炎病毒基因组由两条长度不一的单链形成部分环状结构，长链L(3.2kb)为负链，而短链S为正链。正链长度约为负链的50％-80％左右，其3’末端随不同来源毒株而有所不同，而且不同亚型的DNA变异约为10％，相同亚型间DNA变异率约为2％，最高可达11.5％。HBV基因组的多态性构成了该病毒高度变异率的分子基础。传统观念认为，若患者血清HbeAg阴性，则表示病毒复制停止，病情趋于稳定。然而，近年来的研究显示，大多数的患者常常由于HBV前C区及BCP区变异而导致血清HBeAg水平下降或缺失，但不影响病毒复制，即此时有时HbeAg阴性并不一定反映病毒复制减少或停止。因此，乙型肝炎病毒前C/BCP区基因突变检测对慢性乙型肝炎的早期辅助诊断及治疗有着重要意义。有研究表明，HBV前C区A1896突变在抗乙肝e抗原阳性HBe(+)的慢性乙型肝炎中的检出率达91％，BCP区nt1762A-T，1764G-A联合突变在抗HBe(+)慢性乙型肝炎中检出率为13％。可见，HBV前C区及BCP区变异的检测可为对深入研究慢性乙型肝炎血清学标志物与病毒突变之间的相互关系、揭示病程进展以及治疗和预后提供科学有效的依据。

目前常用的基因突变检测方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(PCR-SSCP)、基因芯片以及DNA序列测定等技术。PCR-SSCP技术用来检测基因突变操作繁琐、检测通量低，而且不能判断特异性位点的突变形式。而RFLP是使用核酸内切酶对扩增后的靶序列进行特异性位点的切割，然后经过电泳检测判断不同的基因型，但是由于HBV基因组分子进化速率较快、变异频繁，因此结果分析准确率较低。近年来，基因芯片技术已经成功应用于核酸分析，对检测HBV基因组多态性具有很大的优势，但因其检测费用昂贵而限制了该技术在临床实验室的推广和应用。因此，本发明人试图结合已知的PCR-斑点印迹杂交技术和过滤杂交方法，建立一种能够在较短的时间内检测和分析HBV基因组前C区和核心启动子区域基因突变的方法。

发明内容

本发明涉及检测个体血液样品中HBV前C区及BCP区突变的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测HBV基因前C区及BCP区突变的方法及所使用的试剂盒。

本发明的一个目的提供一种使用反向斑点杂交技术HBV基因前C区及BCP区突变的方法，该方法包括：(1)分离提取待检样品中的靶DNA分子；(2)利用小分子标记引物并进行聚合酶链反应扩增靶DNA片段；(3)使特异性寡核甘酸探针与靶核酸在适当的基质上杂交；(4)检测杂交结合物并借以判断靶DNA的突变类型。本发明的特征在于聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别是5’-AGGCATACTTCAAAGACTG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GCTCCAAATTCTTTATAAG-3’(SEQ ID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：

探针1：NH2-5’-AGGTTAAAGGTCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：3)

探针2：NH2-5’-AGGTTAATGATCTTTGTA-3’(SEQ ID NO：4)

探针3：NH2-5’-GCTTTGACACATGGA-3’(SEQ ID NO：5)

探针4：NH2-5’-TGGCTTTGGGGCATG-3(SEQ ID NO：6)

探针5：NH2-5’-TGGCTTTGGGACATGG-3’(SEQ ID NO：7)

探针6：NH2-5’-TGCAACTTTTTCACC-3’(SEQ ID NO：8)