[发明专利]一种人类重大病原菌－霍乱弧菌快速检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种人类重大病原菌-霍乱弧菌的快速检测试剂盒，由如下试剂组成：

(a)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，

试剂A：含有NaCl 0.1-0.3M、pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷1-100mM、pH8.0的乙二胺四乙酸0.1-10mM和V/V浓度为0-20％的曲拉通X-100；

试剂B：含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8.0、浓度为1-100mM的三羟基甲基氨基甲烷；

(b)聚合酶链式反应试剂：含有反应预混试剂C和反应引物试剂D，

试剂C：含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2.5-5.0μl、0.5-2.5个单位和18-35.5μl；

试剂D：含有特异引物对VcF和VcR、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl₂，含量分别为0.2-1μM和0.2-1μM、20-200μM及0.5-10mM；

(c)电泳和显色试剂，含试剂E和试剂F，

试剂E：为50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；

试剂F：含W/V为0.8-2％的琼脂糖和0.5-20μg/ml溴化乙锭；

所述VcF特指5′-TTAAGCSTTTTCRCTGAGAATG；所述VcR特指5′-AGTCACTTAACCATACAACCCG。

2.根据权利要求1中所述的一种人类重大病原菌-霍乱弧菌的快速检测试剂盒，其特征是每管反应试剂的配方为5.0μl10倍聚合酶链式反应缓冲液，2.5单位热聚合酶，35.5μl灭菌双蒸水4.0μl 2.5mMdNTP，3.0μl25mM MgCl₂，10pM VcF，10pM VcR。

3.一种使用权利要求1中所述的试剂盒快速检测霍乱弧菌的方法，依次按下列步骤：

(1)按照下列配方配制试剂：

试剂A：含有NaCl 0.1-0.3M、pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷1-100mM、pH8.0的7二胺四乙酸0.1-10mM和V/V浓度为0-20％的曲拉通X-100；试剂B：含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8.0、浓度为1-100mM的三羟基甲基氨基甲烷；

试剂C：含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2.5-5.0μl、0.5-2.5个单位和18-35.5μl；

试剂D：含有特异引物对VcF5′-TTAAGCSTTTTCRCTGAGAATG和VcR5′-AGTCACTTAACCATACAACCCG、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl₂，含量分别为0.2-1μM和0.2-1μM、20-200μM及0.5-10mM；

试剂E：为50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；

试剂F：含W/V为0.8-2％的琼脂糖和0.5-20μg/ml溴化乙锭；(2)按照下列步骤依次进行检测：

(a)样品处理：取0.1-0.5克样品，用100-400μl试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000-12000g离心2-5分钟，弃上清；

(b)DNA提取：用100-300μl试剂A再次悬浮沉淀，并加入20-100μl试剂B混匀，室温放置2分钟以上，再在沸水浴中保温1-10分钟，使细胞完全破裂，释放出DNA；10000-12000g离心8-10分钟，取上清并加入上清体积2倍即240-800μl的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5-10分钟，10000-12000g离心3-8分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10-50μl灭菌双蒸水中，即为DNA提取液；

(c)聚合酶链式反应扩增：以0.5-1μl提取的DNA作为聚合酶链式反应扩增的模板；取21-42μl试剂C与4-8μl试剂D混合；在热循环仪上对提取的DNA模板进行扩增，通过94℃-98℃解链2-5分钟；然后用93-95℃变性30秒-1分钟，58-62℃复性30秒-1分钟，72℃延伸30秒-1.5分钟，如此循环30-35次，最后在72℃保温8-10分钟，将霍乱弧菌的特异片断增加到10⁸mol以上；

(d)电泳和显色检测：取5-10μl扩增后的样品，与2-6μlV/V为0.25％的溴酚蓝混合，W/V为0.8-1.2％的琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条300核苷酸对的条带，如果有一条300核苷酸对的条带，说明样品有霍乱弧菌感染或污染，反之则没有。