[发明专利]一种人类重大病原菌－霍乱弧菌快速检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人类重大病原菌—霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的快速检测试剂盒，进一步涉及使用霍乱弧菌快速检测的试剂盒快速检测霍乱弧菌的方法。

背景技术

霍乱弧菌(V.cholerae)是引起烈性传染病霍乱的病原体，二千多年前已有记载。自1817年以来，已发生过7次世界性霍乱大流行，前6次均由霍乱弧菌古典生物型引起，1961年开始的第7次大流行由霍乱弧菌El Tor生物型引起。1992年一个新的流行株O139(Bengal)在沿孟加拉弯的印度和孟加拉一些城市出现，并很快传遍亚洲，这是首次由非O1群霍乱弧菌引起的流行霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病，经口感染。感染霍乱弧菌的病人主要临床表现为腹泻及呕吐等。严重的可发生剧烈的吐泻，排大量米汤样大便，容易造成严重失水，肌肉痉挛，甚至循环衰竭而死亡。可以说霍乱弧菌是细菌中对人类健康安全危害最大的种类之一，此菌引起的霍乱为我国的甲类法定传染病。另外，非O1群霍乱弧菌还是中国对虾，长毛对虾等对虾的烂眼病，鳗脱粘病的病原体，给水产养殖业带来较大的危害。霍乱弧菌引起的霍乱及其它病具有暴发快、流行广、死亡率高等特点，由于细菌极易对抗生素产生抗药性，因此对霍乱弧菌病应以预防为主，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对弧菌的检测技术主要包括传统的TCBS培养及进一步的形态及生理生化鉴定法、免疫学方法(主要有单克隆抗体技术、酶联免疫检测法(ELISA))、免疫电镜技术、分子生物学方法(主要有分子杂交技术、限制性内切酶长度多态(RELP))等。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长。有些所需的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大医务人员和水产养殖业主掌握的技术难度很大，很难推广，限制了这些技术的应用和发展。

早期快速检测人类重大病原菌-霍乱弧菌是目前预防霍乱暴发流行的主要措施和水产经济动物养殖业减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的检测试剂盒及其检测方法是广大医务工作者和水产养殖者急切盼望的。

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是上世纪80年代发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快就被应用于实践中。

发明内容

本发明的目的是利用霍乱弧菌16S-23S rRNA间区基因保守序列设计的一对引物，建立霍乱弧菌PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供一种人类重大病原菌-霍乱弧菌的快速检测试剂盒及检测方法。该试剂盒可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于人类烈性传染病霍乱的临床检测，也可用于水产动物各时期养殖过程中的细菌跟踪检测，也还可以用于环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。

本发明的主要原理为：试剂A和B将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，试剂C和D为多聚酶链式反应技术试剂，通过试剂D中所含的霍乱弧菌特异DNA片断引物和试剂C中的热聚合酶等成分，对样品释放出的DNA进行特异性的扩增，由于我们设计的引物为霍乱弧菌所特有，因此，如果样品中含有霍乱弧菌，那么它的DNA的特异片断在经过扩增后，浓度将达到10⁸mol(克分子)以上，这样，在电泳和溴化乙锭染色后，紫外光检测就可以探测到一定分子量的目的条带。如果没有霍乱弧菌，则不能扩增到同样分子量的目的条带。

为实现上述目的本发明采取的技术方案是：该人类重大病原菌-霍乱弧菌的检测试剂盒，由如下试剂组成：

(a)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，

试剂A：含有NaCl 0.1-0.3M、pH8.0的三羟基甲基氨基甲烷1-100mM、pH8.0的乙二胺四乙酸0.1-10mM和V/V浓度为0-20％的曲拉通X-100；

试剂B：含有浓度为1-10mg/ml的溶菌酶和pH8.0、浓度为1-100mM的三羟基甲基氨基甲烷；

(b)聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂C和反应引物试剂D，

试剂C：含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2.5-5.0μl、0.5-2.5个单位和18-35.5μl；

试剂D：包括特异引物对VcF和VcR、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl₂，含量分别为0.2-1μM和0.2-1μM、20-200μM及0.5-10mM；