[发明专利]一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法

权利要求书

1.一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法，其特征是按以下步骤；

(1)DNA模板提取：

①取具有弧菌病症状的水产养殖动物病灶组织心、肝、脾、肾和溃疡部位等，匀浆，取匀浆液1.5mL，10000g离心10min，沉淀用双蒸水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1mL双蒸水中，在沸水中煮8～10min，10000g离心10min，其上清液即为DNA模板；

②取未具有弧菌病症状水产养殖动物组织心、肝、脾、肾和肌肉等，匀浆，加入TSB培养基在28℃140r/min摇床上培养18h，取匀浆液1.5mL，10000g离心10min，沉淀用双蒸水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1mL双蒸水中，在沸水中煮8～10min，10000g离心10min，其上清液即为DNA模板；

(2)多重PCR三对引物分别为：

A：5′-TGGTGAACAGCCAGTAAA-3′，5′-CAAACCCATCATAAGTAGTC-3′

B：5′-GGCGGTCGCTCTGGTATT-3′，5′-TTGCCATCGTAAGTGCTGTA-3′

C：5′-CAGAAGAATCGGAAGAACA-3′，5′-TAGAATGACGCACAAAGG-3′；

(3)多重PCR反应体系为：

10×PCR buffer      2.5μl(已加Mg²⁺，终浓度为1.5

                    mmol/L)

dNTP mixture        2μL(终浓度0.25mmol/L)

引物                上下游各2μL(终浓度0.5μmol/L)

DNA模板             1μL(约0.1μg)

ExTaq               1μL(终浓度2U)

ddH₂O               14.5μL

总体积              25μL

(4)多重PCR反应条件为94℃ 5min；65℃ 1min；72℃ 1.5min，共30个循环，72℃ 10min；

(5)取10μL多重PCR反应液进行DNA琼脂糖凝胶电泳，其中凝胶胶浓度为0.8-1.2％。