[发明专利]一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法。

背景技术

随着网箱养殖规模的扩大，病害发生也日益频繁，严重制约了水产养殖业的健康发展。面对不断增多的病原种类，单靠传统的微生物培养方法已经不能满足病害防治的需要。因此，建立灵敏、快速、准确的病原检测技术是及时有效地控制与预防致病菌传播的前提。目前对致病菌的检测，主要依赖于常规微生物学方法，一般需5～7d时间，比较费时费力；另外应用免疫酶试验、免疫荧光试验、基因探针等方法，其灵敏度相对较低、特异性较差，难以推广。自从PCR技术建立，以其敏感度高、特异性强、操作简便、快速而被广泛应用于致病菌的检测，但常规PCR易受环境因素的影响，检测结果易出现假阳性，从而导致错误的诊断。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的不足，提供一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法。

为实现上述目的本发明采取的技术方案是按以下步骤：

(1)DNA模板提取：

①取具有弧菌病症状的水产养殖动物病灶组织心、肝、脾、肾和溃疡部位等，匀浆，取匀浆液1.5mL，10000g离心10min，沉淀用双蒸水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1mL双蒸水中，在沸水中煮8～10min，10000g离心10min，其上清液即为DNA模板。

②取未具有弧菌病症状的水产养殖动物组织心、肝、脾、肾和肌肉等，匀浆，加入TSB培养基在28℃140r/min摇床上培养18h，取匀浆液1.5mL，10000g离心10min，沉淀用双蒸水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1mL双蒸水中，在沸水中煮8～10min，10000g离心10min，其上清液即为DNA模板。

(2)多重PCR三对引物分别为：

A：5′-TGGTGAACAGCCAGTAAA-3′，5′-CAAACCCATCATAAGTAGTC-3′

B：5′-GGCGGTCGCTCTGGTATT-3′，5′-TTGCCATCGTAAGTGCTGTA-3′

C：5′-CAGAAGAATCGGAAGAACA-3′，5′-TAGAATGACGCACAAAGG-3′；

设计A、B和C上下游引物各2OD，引物A上、下游引物分别用1040μL和980μL双蒸水稀释，引物B上、下游引物分别用1240μL和1060μL双蒸水稀释，引物C上、下游引物分别用920μL和1000μL双蒸水稀释。

(3)多重PCR反应体系为：

10×PCR缓冲液   2.5μL(已加Mg²⁺，终浓度为1.5mmol/L)

dNTP混合液      2μL(终浓度0.25mmol/L)

引物A、B、C     上下游各2μL(终浓度0.5μmol/L)

DNA模板         1μL(约0.1μg)

ExTaq           1μL(终浓度2U)

ddH₂O           14.5μL

总体积          25μL

(4)多重PCR反应条件为94℃5min；94℃1min，65℃1min，72℃1.5min，共30个循环；72℃ 10min。

(5)取10μL多重PCR反应液，按常规DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测反应液中扩增的条件，在凝胶成像系统中照像，如出现图1的反应条带则致病菌为溶藻弧菌。

为了尽量克服PCR检测溶藻弧菌带来的假阳性，三对引物同时放入到PCR体系中同时扩增，构成多重PCR检测法。引物A、B、C分别是根据溶藻弧菌的三种外毒素基因序列即胶原蛋白酶、外膜蛋白K和ToxR的保守区设计的，对溶藻弧菌有较强的特异性。与普通PCR检测方法相比，本实验采用的多重PCR有更高的灵敏度和准确性；与采用免疫学ELISA检测方法相比，多重PCR花费小、检测时间短、实验条件要求相对也不太严格。

附图说明

图1是多重检测溶藻弧菌电泳结果图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明。

实施例1