[发明专利]一种土壤羟胺还原酶活性检测时的显色方法

说明书

技术领域

本发明涉及应用分光光度法检测土壤中羟胺还原酶活性过程中的显色方法，具体地说是一种应用配合物显色方法间接测定土壤培养液中羟胺浓度的显色方法。

背景技术

土壤中的羟胺还原酶能将在土壤中氮代谢(亚硝酸盐的还原或者氨的氧化)过程中形成的中间产物羟胺还原成氨，土壤中的还原态化合物可作为氢的供体。

因此，土壤中羟胺还原酶活性的强弱影响到土壤氮代谢过程中氮素的氨挥发损失，间接影响氮肥的利用效率。土壤中羟胺还原酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中羟胺还原酶活性的检验有很重要的意义。而到目前为止，有关羟胺还原酶活性的测定基本都是参照Φ.X.哈兹耶夫[苏]著，郑洪元、周礼恺、张德生译的《土壤酶活性》一书中的方法。该书中所推荐使用的方法为提取液中加入过量的乙酸酐和FeCl₃，显色机理为被羟胺还原所得的Fe²⁺离子与醋酸酐的羰基作用而显褐色，测定Fe²⁺离子的浓度，即可间接测定原溶液中羟胺的浓度。其不足之处在于应用此种显色方法所测得的羟胺的浓度较用碘量法所测得的浓度偏低，常形成较大的系统误差。这可能是由于醋酸酐和Fe²⁺形成配合物时的稳定常数较低所导致。应用此法所测定的羟胺还原酶活性的在测量精确度方面也有所欠缺。另外，由于涉及到乙酸酐(冰毒前体)的应用，购买乙酸酐需要公安部门的毒品证明，无形中降低了分析的时效性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检验土壤中羟胺还原酶活性时的显色方法。该方法是在借鉴前人所应用的显色方法的原理基础上，对羟胺还原酶活性的测定过程中的显色方法进行了改进。改进后的显色方法较乙酸酐-三氯化铁法更灵敏、系统误差较小、准确度和精密度更高、显色剂用量更少，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

参照Φ.X.哈兹耶夫[苏]著，郑洪元、周礼恺、张德生译的《土壤酶活性》一书中的方法进行土壤培养，即：

1)取0.5-1.0g风干土壤置于100ml带磨口塞得瓶中，加入10-20mg碳酸钙，仔细混合均匀；然后加入1-2ml 0.5-1％的盐酸羟胺溶液和1-2ml1％的葡萄糖溶液；在10-12mm水银柱的压力下抽出瓶中空气；将瓶仔细摇匀，并在30±1℃恒温箱中放置5±0.2h；用灭菌土壤加试剂作为对照；在培养结束后，向瓶中加入50ml蒸馏水和2-3ml铝钾矾饱和溶液，摇均后用致密滤纸过滤得提取液；

2)取土壤培养后的提取溶液1ml于50ml容量瓶中，加入含Fe³⁺0.002-0.01mol·L^-1的三价铁盐溶液1-5ml、0.8-2.0g·L^-1α-α’联吡啶溶液1-5ml，然后用蒸馏水定容至刻度，显色反应在常温下进行，所得溶液显橙色，显色达到稳定，在520nm下用分光光度计比色测定其吸光值为A；

3)在520nm下比色测定一系列两组或两组以上已知浓度的羟胺溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00gNH₂OH l·L^-1的吸光值A’，以羟胺溶液的浓度和测定的吸光值A’制作标准曲线，得到斜率b；

4)根据吸光值A和斜率b，计算提取液中的羟胺浓度S：S＝A*b，其中，A为提取液的吸光值，b为标准曲线的斜率；

5)计算样品中的羟胺浓度；

6)计算羟胺还原酶活性，计算公式为：[(S₁-S)V₁V₂/1000V₃]/W，单位mgNH₂OH·g^-1soil·5h^-1；式中，S₁为对照中的NH₂OH含量(mg·L^-1)；S为样品中的NH₂OH含量(mg·L^-1)；V₁为提取液总体积(ml)；V₂为显色时定容后的溶液体积(ml)；1000为单位转换系数；V₃为测定时所取滤液体积，W为称土样重(g)。