[发明专利]一种鳗弧菌油乳化二价口服疫苗及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及鱼用疫苗，具体地说是一种鳗弧菌油乳化二价口服疫苗及其制备。

背景技术

目前水产养殖中常用的口服疫苗，是使用生物可降解物质(常用聚乙烯醇、丙烯酸树脂、海藻胶或脂质体)包被一种病源菌株的被膜或全细胞疫苗所制备，这种疫苗只针对病源菌的一种血清型对养殖动物起到保护作用，免疫保护谱窄，所使用的生物可降解材料成本高。

发明内容

本发明目的在于为了克服现有技术在口服免疫水产养殖动物中免疫保护谱窄、材料成本高的缺点，提供一种可针对不同血清型鳗利斯顿氏菌油乳化二价口服疫苗及其制备。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

鳗利斯顿氏菌01血清型亚型菌株CGMCC No.1870(M3)形态特征：

菌株在2216E培养基24h的菌落呈圆形、半透明，表面光滑、边缘整齐，直径约1.5mm；在TCBS培养基的菌落呈黄色，直径约3mm；革兰氏染色阴性，短杆状。可运动。有一根很长的极生单鞭毛和周生菌毛，菌体大小为0.8～1.0×1.5～1.7μm。

M3菌株氧化酶反应阳性，对弧菌抑制剂0/129(2，4-二氨基-6，7-二异丙基喋啶磷酸盐，150ug/mL)敏感，发酵葡萄糖不产酸，不产色素

鳗利斯顿氏菌01血清型亚型菌株CGMCC No.1871(SMP1)形态特征：

菌株在2216E培养基24hr的菌落呈圆形、半透明、表面光滑、边缘整齐。在TCBS培养基上不生长。革兰氏染色阴性，弯杆状，可运动，有一根很长的极生单鞭毛。

SMP1菌株氧化酶反应阳性，对弧菌抑制剂0/129(2，4-二氨基-6，7-二异丙基喋啶磷酸盐，150ug/ml)敏感，发酵葡萄糖产酸不产气，不产色素，脲酶阴性，根据这些特征并结合形态特征，可判定SMP1为弧菌科弧菌属细菌。

生理生化测试的特征参见表1，

+：阳性，-：阴性。

疫苗由油相和水相组成，水相中加入利斯顿氏菌属Listonella MacDonelletCollwell的鳗利斯顿氏菌Vibrio anguillarum 01血清型两种亚型菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC No.1870和CGMCCNo.1871)的菌悬液。

所述水相为Tween-80，按体积百分比计94％-98％的鳗利斯顿氏菌01血清型两种亚型菌株的菌悬液和2％-6％的Tween-80；油相为：Span-80、硬脂酸铝和运动黏度7-13的白矿油；油相中各成份为：按体积百分比计92％-96％的运动黏度7-13的白矿油和4％-8％的Span-80和按油相总质量体积比的1.5％-2.5％的硬脂酸铝，其中水相和油相按体积比计为1∶1.5-2，所述两种菌悬液浓度各为1-6×10⁹cells/ml。

疫苗的制备方法：

1)制备乳化疫苗的水相：将Tween-80加入到复壮培养培养后并甲醛灭活的利斯顿氏菌属Listonella MacDonellet Collwell的鳗利斯顿氏菌Vibrioanguillarum 01血清型两种亚型菌株CGMCC No.1870和CGMCC No.1871的菌液中，搅拌混匀，得到乳化疫苗的水相；其中菌悬液占水相体积比的94％-98％，Tween-80占水相体积比的2％-6％；

2)制备乳化疫苗的油相：按体积百分比计取92％-96％的运动黏度7-13的白矿油、4％-8％的Span-80和按总油相质量体积比1.5％-2.5％的硬脂酸铝，将其混合，加热使硬脂酸铝溶化，即得到乳化疫苗的油相；

3)制备乳化疫苗：1倍体积的水相缓慢加入到1.5-2倍体积油相中，以1000-1500rpm的转速进行磁力搅拌10-20分钟，即得到油包水性乳化二价疫苗。

所述两种菌株复壮培养至浓度各为大于10⁹cells/ml。

本发明所具有优点如下：

1.本发明采用鳗利斯顿氏菌01血清型两种亚型菌株制备的油乳化二价口服疫苗可以拓宽疫苗保护谱、增加疫苗的免疫协同作用，诱导水产养殖动物肠道的非特异性和特异性免疫应答，并提供保护效应。

2.制备本发明的油乳化二价口服疫苗，所使用的材料成本低。

附图说明

图1为本发明鳗利斯顿氏菌M3菌株的形态图。

图2为本发明鳗利斯顿氏菌SMP1菌株的形态图。

图3为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆后肠溶菌酶活力变化情况图。