[发明专利]一种表达植酸酶的转基因植物的制备方法

权利要求书

1.植酸酶植物重组表达载体，其特征是该重组表达载体主要含有以下序列：启动子序列，来源于微生物的植酸酶基因，信号肽和蛋白体定位序列和终止子序列。

2.按照权利要求1的植酸酶植物重组表达载体，其特征是：所述的启动子序列选自单子叶植物组成型启动子、单子叶植物诱导型启动子或单子叶植物组织特异性启动子。

3.按照权利要求1的植酸酶植物重组表达载体，其特征是：所述的启动子序列是SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；所述的来源于微生物的植酸酶基因是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述的信号肽和蛋白体定位序列是SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；所述的终止子序列是SEQ IDNO：4或SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列。

4.按照权利要求1的植酸酶植物重组表达载体，其特征是：所述的植酸酶植物重组表达载体是PHP20723AO或PHP20723MO。

5.按照权利要求1的植酸酶植物重组表达载体，其特征是：所述的植酸酶植物重组表达载体是PHP20754AO或PHP20754MO。

6.权利要求1所述的植酸酶植物重组表达载体的构建方法，其特征在于包括：将信号肽和液泡蛋白体定位序列、来源于微生物的植酸酶基因和终止子序列连接在一起后，可操作的连接到启动子序列之后。

7.权利要求4植酸酶植物重组表达载体的构建方法，包括：

(1)、构建表达载体PHP20723：(a)合成Seq ID No：9所示的信号肽和蛋白体定位序列融合片段；(b)分离得到Seq ID No：3所示的玉米胚特异表达的启动子序列；(c)分离得到Seq ID No：4所示的玉米胚芽蛋白终止子序列；(d)将Seq ID No：9和Seq ID No：3融合在一起后再与Seq ID No：4先后克隆到pSP72载体上，构建成表达载体PHP20723；

(2)、将Seq ID No：1序列用BclI和XbaI酶切后与经过同样酶切处理的表达载体PHP20723相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20723AO；将Seq ID No：2用Nco I和Sma I酶切后与经过同样酶切处理的表达载体PHP20723相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20723MO。

8.权利要求5植酸酶植物重组表达载体的构建方法，包括：

(1)、构建表达载体PHP20754：(a)合成Seq ID No：9所示的信号肽和蛋白体定位序列融合片段；(b)按照现有技术分离得到Seq ID No：5所示的玉米胚乳蛋白启动子片段；(c)按照现有技术分离得到Seq ID No：6所示的玉米胚乳蛋白终止子片段；(d)将Seq ID No：5和Seq ID No：9融合，将融合后的片段与SeqID No：6先后克隆到pSP72载体上，构建表达载体PHP20754；

(2)、将Seq ID No：1用BclI和SmaI酶切后与经过同样酶切处理的表达载体PHP20754相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20754AO；将Seq ID No：2用Nco I和Sma I酶切后与经过同样酶切处理的表达载体PHP20754相连接，得到植酸酶植物重组表达载体PHP20754MO。

9.一种制备表达植酸酶的转基因植物的方法，该方法包括：将权利要求1构建成的植酸酶植物重组表达载体按照常规转化方法转化受体农作物，培育、筛选再生植物，即得。

10.按照权利要求9的方法，其特征是：所述的植酸酶植物重组表达载体为PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO或PHP20754MO；所述的转化方法为农杆菌侵染法或基因枪法；所述的受体农作物选自玉米、油菜、大豆或小麦。

11.按照权利要求9的方法，其特征是：将权利要求1植酸酶植物重组表达载体与植物选择标记基因表达载体共转化受体农作物。

12.按照权利要求11的方法，其特征是：所述的植酸酶植物重组表达载体选自PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO或PHP20754MO；所述的植物选择标记基因表达载体是PHP17042Bar；所述的受体农作物是玉米。

13.按照权利要求12的方法，其特征是：将PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO、PHP20754MO以及选择标记基因表达载体PHP17042Bar去除细菌骨架DNA，分别得到植酸酶基因表达盒以及PHP17042Bar的Bar基因的表达盒，将Bar基因的表达盒分别与以上四种去除细菌骨架DNA后的植酸酶基因表达盒等摩尔比混合，用于基因枪微弹制备，转化玉米外植体。