[发明专利]一种表达植酸酶的转基因植物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物重组表达载体、转基因植物，尤其涉及植酸酶重组表达载体以及由该表达载体转化受体农作物所得到的表达植酸酶的转基因植物，本发明还涉及该植酸酶重组表达载体和转基因植物的制备方法以及该转基因植物作为动物饲料的应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

磷是动物生长、发育、繁殖所必需的重要矿物元素。植酸磷(六磷酸肌醇)，是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达1-5％，占植物中总磷的60-80％(Nelson T.S.et al.，Poultry Sci.47：1842-1848，1968)，是动物饲料中的重要成分。但是由于单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶，导致以植酸磷形式存在的磷不能被直接利用，其利用率仅有0-40％，从而在饲养过程中造成了许多问题：一、磷源浪费。首先是饲料中磷源不能得到有效利用；其次，为了满足动物对磷的需求，实际生产中要在饲料中额外添加无机磷，因此提高了饲料成本。二、形成的高磷粪便污染环境。饲料中85％左右的植酸磷不能被动物有效利用而直接排出体外，造成严重的土壤和水源磷污染，引发例如水环境的富营养和藻类过度生长等不良情况。三、植酸磷是抗营养因子，在动物胃肠道的消化吸收过程中与钙及其它多种金属离子、蛋白质和一些营养物质结合，形成不易被单胃动物吸收和利用的鏊合物，不但造成磷源浪费而且影响了这些营养物质特别是钙离子的吸收利用，不仅增加了饲料成本还降低了动物生产性能。

我国是世界上最大的禽畜养殖大国，每年产生禽畜粪便高达17.3亿吨，粪便磷排放量为363万吨。因高磷粪便带来的环境污染问题非常严重。同时，我国也是缺磷大国，磷是我国饲料业中仅次于蛋白质的第二大缺口资源。其实，饲料作物如谷物、玉米、大豆、油菜等的总磷含量一般在1％左右，其含量足以满足动物对磷的营养需求。如何通过品质改良来提高饲料作物中磷的可利用率，减轻高磷粪便造成的污染问题，是我国禽畜业需要解决的迫切问题。

植酸酶是一种能将植酸磷降解成肌醇和无机磷酸的酶，作为饲料添加剂它可使玉米等植物性饲料中磷的利用率提高60％，动物粪便中磷的排出量减少40％，从而减少饲料中无机磷的添加量，降低饲料成本，减少高磷粪便造成的环境污染，还可降低植酸磷的抗营养作用。植酸酶作为新型单胃动物饲料添加剂，年销售额估计为1亿美元，且不断增长。主要应用于猪、鸡、鸭等单胃动物和水产养殖类动物，应用范围广、需求量大，其优良的饲喂效果在世界范围内得到确认，对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。(Ware J.H.et al.，US Patent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition 101：1289-1294，1971)。

随着植酸酶的发现和应用，人们意识到通过基因工程手段来提高饲料作物中磷的可利用率是一更有效、更切实可行的思路，它的基本原理是在不降低作物中植酸磷本身含量的情况下，在植酸磷存在的同时也使作物含有植酸酶，在动物消化过程中自动将植酸磷降解成可利用的无机磷。

中国专利申请号为03137476.X的发明专利申请公开了一种利用基因工程方法在转基因植物中高效生产植酸酶的方法，但该方法存在如下几方面的不足，有待改进：(1)表达的外源蛋白没有定位到合适的细胞器中，因而酶蛋白不稳定，实际表达量减少，最终导致酶活性较低(仅300-2000U/Kg)；(2)使用的种子特异性启动子仅在胚中表达；(3)仅选用了一个植酸酶基因，该植酸酶最适pH中性，比活性为100U/mg，适用范围较窄。

发明内容

本发明目的之一是为了克服现有技术的不足，提供一类新的植酸酶植物重组表达载体，该植酸酶植物重组表达载体转化到受体植物中后，可在植物器官(种子、叶片、茎杆)中高效、定点表达，得到富含植酸酶的植物饲料新品种。

本发明目的之一是通过以下技术方案来实现的：

植酸酶植物重组表达载体，该重组表达载体主要含有以下序列：启动子序列，来源于微生物的植酸酶基因，信号肽和蛋白体定位序列和终止子序列。