[发明专利]一种新颖酶联－环介导等温基因扩增技术(E－LAMP)的建立与应用

说明书

技术领域

本发明是酶联-环介导等温扩增技术(E-LAMP)用于HCV RNA病毒检测。用于RNA病毒在各种生物制品、献血者、病人血液标本等的监测。应用范围包括人用、兽用及其他生物防御用。

背景技术

1、病毒基因检测技术的现状

自核酸的体外扩增变为现实以来，各种核酸扩增酶与核酸扩增方法层出不穷，基因诊断技术也被愈加广泛地用于疾病监控、基因突变和基因特征的分析等研究中。迄今，建立的靶基因扩增放大方法主要有最广泛使用的PCR、bDNA、SDA、3SR、NASBA等。尽管这些方法都具有很强的核酸放大能力，但在仪器需求和实验的可操作性方面存在很多弊端。臂如：PCR需要对双链进行热变性过程才能启动下一轮的扩增反应；在NASBA和3SR技术中通过一些特殊的转录和反转录过程才能进行核酸的扩增，虽然省去了核酸的变复性过程，但在引物设计时还要加入转录酶的特异性结合位点；SDA和bDNA检测技术则通过特殊内切酶的使用在等温条件下进行核酸扩增和信号放大。

相形之下，两种近年发展起来的环介导等温基因扩增检测技术，即环介导等温扩增技术(LAMP)与滚环复制放大技术(RCA)，具有更高的灵敏度和特异性，而且在扩增时间和可操作性方面显示出强大优势。在这两种技术中分别使用了特异对应于靶序列的引物或探针，在连接酶(或反转录酶)和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增。整个扩增反应并不需要核酸的变复性过程和特殊仪器，在1.5-3小时内即可完成。这两种检测技术在可操作性、灵敏度以及特异性方面表现出来的优越性使其倍受研究者的青睐，并已成功应用于各种基因的检测。

2、丙型肝炎病毒

全世界有1.7亿HCV的慢性感染者，每年新增10万人以上的肝癌患者。众所周知，肝癌与慢性肝炎是密不可分的。根据WHO在2002年发布的一项报告显示，在2001年由于慢性肝炎引起的死亡人数达到140万，其中至少20％(28万人以上)是因丙型肝炎引起的。尽管在丙型肝炎的诊断和治疗方面的研究已经有了长足的进展，但在发展中国家，由于丙型肝炎不能得到及时的诊断和治疗而引起的病死率还在不断增加。HCV感染的诊断主要依赖于血清抗体的ELISA检测和病毒基因的检测，但由于感染初期抗体水平很低，抗体的检测总会使一些窗口期传染源漏检，尤其在免疫抑制型患者(如合并HIV感染的患者)中更易表现为假阴性，而利用抗体检测核心抗原的技术一直是一个很难突破的瓶颈。基于PCR的基因检测技术(NAT)具有更高的灵敏度，尤其在转氨酶为正常水平，抗体尚未出现时，此技术便成为一种可信赖的丙型肝炎实验室诊断方法。因此，欧洲药管局已将HCV-RNA的检测列为HCV病毒检测的强制执行项目。在丙型肝炎的传播中输血也是一个最重要的途径之一，这为丙型肝炎的预防工作带来很大压力。虽然通过对献血员严格的监测和筛查使这种危险已大幅度减弱，但在输血过程中丙肝病毒传播“零危险”的目标也很难达到。随着NAT技术的日趋完善，一些发达国家已将此技术用于血库的常规筛查项目，这使窗口期病人的漏检率有了显著的降低。据报道，较免疫学检测，NAT技术可将HCV的平均窗口期提前25天以上，使献血员传播HCV的概率降低72％左右。因此，现阶段在世界范围内开展大规模血液筛查也多采用NAT技术。

目前HCV的NAT检测中，PCR和荧光PCR(TaqMan)最为常见。虽然这两种技术检测灵敏度高，但因其费用昂贵、操作复杂，在发展中国家很难作为血库的常规检测推广。因此，简化操作手段和缩短检测时间成为发展和改造基因检测方法的重点，本发明中所研究和建立的方法正是迎合这两个重点进行的。

3、逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)