[发明专利]兔胚胎干细胞系及其建系方法

说明书

发明背景

小鼠因多种优点而被广泛地应用于生物学和医学研究。一方面，业已建立了许多具有同源遗传背景的野生型同类小鼠品系。另一方面，业已建立和表征了许多具有遗传突变的小鼠模型，这些遗传突变体大多通过同源重组技术获得(Robertson et al.，1986；Thompson et al.，1989；Babinet etal.，2001)。这些遗传突变小鼠的个别基因被缺失、增加或被修饰，这样的小鼠在遗传和发育生物研究领域具有非常重要的作用。有些小鼠的遗传突变模拟人类的疾病状况(Holschneider et al.，2001；Harada et al.，1999；Kulkarni et al.，1999)，这类小鼠为阐明人类疾病的发病机理提供了非常有价值的动物模型。

虽然小鼠在遗传学研究方面具有重要作用，但是由于其个体较小，对于某些需要较大个体的动物的生物学实验却并不是理想的模型动物。基于这种原因，兔长期以来作为优选的模型动物被广泛运用于心血管、肺等器官疾病的研究中。兔还被广泛用于生产抗体、代谢病研究和药物筛选等方面，因为这些实验需要频繁的采取血样，较大个体的动物更适合于此类研究(Graves et al.，1993)。兔孕期短(31天)，饲养方便，在生物、医学及药学研究中具有重要的作用。

兔还具有重要的经济价值，譬如兔的毛皮(安哥拉长毛兔)可运用于纺织工业。使用转基因技术，还可在兔乳汁中生产人类酶蛋白，用于治疗由于酶蛋白遗传缺陷引起的人类疾病。利用兔或兔细胞系来生产人源化抗体，在医药研究领域具有广泛的用途。

胚胎干细胞是一种由着床前胚胎的内细胞团在体外培养而成多能干细胞(Evans et al.，1981；Gail et al.，1981)。这种细胞能在体外长期传代而不影响其发育潜能，而且能保持稳定的二倍体核型。将胚胎干细胞重新引入到早期胚胎中，它们能发育成机体的每一种细胞类型，包括生殖细胞(Bradley et al.，1984)。

在早期的研究中，从兔囊胚中分离培养出一种“可能的”胚胎干细胞，在体外能长期培养(Graves et al.，1993)，能分化形成类胚体。然而，这种细胞系是在血清培养基中建立培养而成的，血清中的许多成分使得胚胎干细胞发生很高的自发分化率。这种细胞能在体外培养多长时间并仍能保持参与胚胎发育的潜能，仍属未知。另外，作者未能提供诸如表面标志物的表达、畸胎瘤的形成，分化的多能性等胚胎干细胞相关的特征信息。

人胚胎干细胞于1998年首次建立(Thomson et al.，1998；Reubinoff etal.，2000)。未分化的人胚胎干细胞能在体外长期培养，表达碱性磷酸酶、许多表面标志物及多能性相关的标志物，在体外培养中能形成类胚体，在免疫缺陷小鼠体内能形成畸胎瘤。

虽然不同物种的胚胎干细胞具有相似的特点，比如：在饲养层细胞上生长良好，具有高核质比，在体外在化学成分相对明确的培养基中能长期培养，但是不同物种的胚胎干细胞在很多方面存在着固有的不同。从不同物种的胚胎中分离干细胞的过程中，需要调整不同的影响因素至最佳状态。例如：最适的胚胎发育时期对分离胚胎干细胞成功与否至关重要，大多数小鼠和兔胚胎在受精后3-4天发育至囊胚期，而人胚胎发育至囊胚阶段需5-6天。人、小鼠和兔三个物种的囊胚和内细胞团的形态和生长动态各不相同。此外，在原代的由内细胞团、囊胚或完整胚胎生长出的细胞团中，准确地识别出未分化胚胎干细胞、滋养层细胞和其他类型细胞至关重要，以便能够特异性地挑选出未分化的胚胎干细胞进行传代。这依赖于对早期不同胚胎细胞类型的形态和行为的详尽了解，不同物种早期胚胎细胞的形态和行为是各不相同的。而且，在培养不同物种的胚胎干细胞时，培养体系中相同组分需要调整到不同的状态，以满足特定物种的胚胎干细胞的最适需要。比如，大多数小鼠胚胎干细胞在较厚的饲养层细胞上生长良好，而大多数人胚胎干细胞最适宜生长在较薄的饲养层细胞上。小鼠胚胎干细胞能用剧烈的酶消化的方式进行传代，而相同的传代方式可能增加人胚胎干细胞染色体异常的几率(Buzzard et al.，2004)。由此可见，似乎不太可能利用现成的人和小鼠胚胎干细胞的建系方法进行其他哺乳动物的胚胎干细胞建系。

因此，有必要建立一种新的方法来建立兔胚胎干细胞系(rbES)，使其能够在体外长期维持未分化状态，并保持正常的核型。

发明内容

一方面，本发明提供了一种利用无血清培养体系建立多能兔胚胎干细胞系的方法，包括下列步骤：

(a)收集囊胚期的兔胚胎；