[发明专利]从全基因组中富集甲基化DNA的方法及其所用层析柱组

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种从全基因组中富集甲基化DNA的方法及其所用层析柱组。

背景技术

正常细胞功能的发挥与细胞本身的遗传信息、遗传调控和表观遗传调控相关，随着人类基因组计划的实施，国内外对基因组所携带的遗传信息在疾病发生、发展中的重要作用已有比较深入的研究。相对而言，染色质所携带的表观遗传信息在疾病发生、发展中的重要作用才刚开始被认识，表观遗传学基因组正在兴起。表观遗传学的过程包括DNA甲基化，组蛋白的修饰和ATP依赖的染色质的修饰，都可以引起基因表达的改变。其中DNA的甲基化是目前的一个研究热点。

疾病的发生、发展是细胞内遗传本身、遗传调控和表观遗传调控的紊乱。大量的临床和基础研究结果表明除了遗传因素，环境因素在大多数疾病发生、发展中有巨大的影响，而表观遗传调控机制在遗传因素和环境因素的互动关系中起了桥梁的作用，已有的研究结果表明表观遗传因素的作用占百分之七十左右。近年的研究更进一步指出表观遗传调控机制在多种疾病发生中起主导作用。基因表达的表观遗传调控是保证细胞内基因的时空正确表达所必需的。因此，当表观遗传调控出现异常时，在胚胎发育阶段可能引起各种先天性的发育缺陷，在成体阶段可能造成各种疾病的发生。后基因组时代表观遗传学的兴起为解开生命奥秘及征服疾病带来了希望。

在哺乳类动物中，胞嘧啶的甲基化是惟一已知的DNA内源性修饰方式，即通过DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase，Dnmt)的催化作用，将甲基基团加在胞嘧啶的5’C位置处。在哺乳类动物细胞中，大多数5’-甲基胞嘧啶(5mC)以双核苷酸CpG的形式出现。CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均匀，其中密度较高的区域称为CpG岛(CpGisland)。人类50％～60％的基因有CpG岛，据估计整个基因组有45,000个CpG岛，并且几乎总是位于基因启动子和(或)外显子周围。除了印记基因和女性失活的X染色体的几个基因外，正常情况下，在CpG岛的CpGs总是非甲基化的，而大多数CpG岛之外的CpGs则是甲基化的。

DNA甲基化的机制及其作用尚未完全清楚，目前认为它与控制基因表达、DNA修复、外源基因的识别和剔除、以及染色体的稳定性等相关。已证实，CpG岛的甲基化可以直接导致相关基因的表观遗传学沉默，启动子区域CpG岛甲基化是与基因突变和缺失相并列的抑癌基因失活的第3种途径，并成为近年来肿瘤研究的热点之一。

随着生物技术的进步，DNA甲基化的检测手段日渐丰富，常用技术的基本原理主要可以归纳为四个方面：一种是依赖化学物质对甲基化和非甲基化胞嘧啶的化学活性不同，将甲基修饰基团的差别转变为碱基序列的不同，从而加以分离；另一种是依赖甲基化和非甲基化胞嘧啶对特定的限制性内切酶处理的不同反应而实现；第三种是依据差异性杂交的原理；第四种则是依靠甲基化CpG结合(methyl-CpG-binding domain，MBD)蛋白家族对甲基化以及非甲基化的CpG序列的结合能力的不同进行分离。此外，还有单核苷酸法、甲基化接受力的检测法等多种技术，这些技术极大地促进了表观遗传学的研究，推动了表观基因组学研究的开展。目前虽然已经存在较多的DNA甲基化的检测技术，但是每种方法都有一定的局限性，难以达到大规模和全基因组范围的分析。例如：目前大量使用的基于亚硫酸氢钠对DNA的修饰的各项技术，包括甲基化特异性的PCR，即MSP，以及被视为金标准的亚硫酸盐测序法，即BSP，均由于亚硫酸氢钠对DNA修饰技术本身的瓶颈——改变了原有DNA的二级结构，导致DNA不稳定；难以准确有效的保证亚硫酸氢盐对DNA的修饰程度；改变了原有DNA的碱基序列，增加了后续实验室操作，包括PCR等的难度，而难以得到大规模的应用；同样的，基于限制性内切酶的检测技术由于受到酶切位点的限制，也难以在全基因组的范围内大规模应用。现有的表观基因组学急需在高通量、大规模的研究技术方面得到突破，以满足全面地了解在疾病的发生过程中甲基化谱式的改变的需要。如果能出现一种灵敏而特异的富集甲基化和/或非甲基化DNA的方法，将有效规避上述几种常用实验技术的弊端，大大增加大规模DNA甲基化检测的发展和应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从全基因组中富集甲基化DNA的方法，能有效提高甲基化DNA富集的特异性和敏感性。为此，本发明还要提供该方法所用的层析柱组。

为了解决上述技术问题，本发明从全基因组中富集甲基化DNA的方法包括如下步骤：