[发明专利]高纯度载脂蛋白A－I的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质制备，尤其涉及载脂蛋白A-I的制备方法。

背景技术

载脂蛋白A-I(Apolipoprotein A-I，apoA-I)是高密度脂蛋白(HighDensity Lipoprotein，HDL)的主要载脂蛋白，为单一多肽链，由243个氨基酸残基组成，分子量28.3kD。HDL主要功能是参与胆固醇逆向转运(ReverseCholesterol Transport，RCT)，将外周组织细胞中的胆固醇移出并转运至肝脏转化清除，因而具有对抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)发生及发展的重要作用，而apoA-I是HDL抗AS功能的主要承担者。apoA-I还具有抗炎抗内毒素的功能，因此是脂类代谢研究重点之一。由于apoA-I具有肝脏靶向作用的特点，在靶向药物研究中也有良好的应用前景。

目前，获得apoA-I的常用制备方法有超速离心法、有机溶剂沉淀法和高效液相法等，虽然能得到高纯度apoA-I，但具有一些很明显的缺点：①制备量小，一般只能获得毫克级的apoA-I蛋白，不适于工业生产；②蛋白得率低，经超离心、有机溶剂沉淀、柱层析等多步处理，在制备过程中损失了大部分apoA-I；③成本高，需要超速离心机等贵重仪器；④安全性差，乙醇、丙酮、三氯乙酸等有机溶剂不仅具有生理毒性，而且易燃易爆，不利与安全生产。

另一方面，血浆组份四是人血浆经Cohn低温乙醇法处理后的剩余部分，常因不能利用而被丢弃，其主要蛋白成分是白蛋白和β脂蛋白。

因此，本领域迫切需要提供一种制备apoA-I的方法，该方法的蛋白得率高、能较好地保持蛋白活性，同时成本低、而且适合于大规模的工业生产。另外，该方法还能将被丢弃的组份四加以合理应用，使血浆资源得到更充分的利用。

发明内容

本发明旨在提供一种从人血浆中获得apoA-I的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种获得载脂蛋白A-I的方法，它包括步骤：

a.将经Cohn低温乙醇法获得的组份四和1-8M的尿素混合形成组份四预处理溶液；

b.步骤a得到的组份四预处理溶液流过阴离子交换层析柱后，用含1-8M尿素，电导值1-4ms/cm的缓冲液I洗涤层析柱，得到含初步纯化的载脂蛋白A-I的洗脱液I；

c.洗脱液I流过阴离子交换层析柱，用电导值1-15ms/cm的缓冲液II洗脱杂质后用电导30-100ms/cm的缓冲液III洗脱下纯化的载脂蛋白A-I。

在另一优选例中，步骤a中组份四和尿素的重量比为1∶30-300。

在另一优选例中，步骤a中组份四和尿素的重量混合比为1∶90-240。

在另一优选例中，步骤a中组份四和尿素的重量混合比为1∶150-210。

在另一优选例中，步骤a、b中所述的尿素浓度为3-8M。

在另一优选例中，步骤a、b中所述的尿素浓度为5-7M。

在另一优选例中，缓冲液I的电导值为2-4ms/cm；缓冲液II的电导值为7-15ms/cm；缓冲液III的电导值为70-95ms/cm。

在另一优选例中，缓冲液I的电导值为2.5-3.6ms/cm；缓冲液II的电导值为9-12ms/cm；缓冲液III的电导值为80-90ms/cm。

在另一优选例中，步骤b、c中的洗脱缓冲液I、II或III中含有NaCl、KCl、MgCl₂或CaCl₂。

在另一优选例中，步骤b、c中的洗脱缓冲液I、II或III中含有NaCl。

在另一优选例中，步骤c所述的缓冲液II或III中含有0-1M尿素。

在另一优选例中，所述的阴离子交换层析柱为弱酸性或弱碱性阴离子交换层析柱。

在另一优选例中，所述的阴离子交换层析柱为QAE或DEAE阴离子交换层析柱。

在另一优选例中，所述的阴离子交换层析柱为DEAE阴离子交换层析柱。

在另一优选例中，步骤a和b之间还包括步骤a’：将组份四预处理溶液离心除不溶性杂质，并用滤膜过滤。

在另一优选例中，离心速度为6000-10,000rpm，滤膜孔径为0.2-0.6μm。

在另一优选例中，步骤b和c之间还包括步骤b’：用电导值4.5-70ms/cm的缓冲液IV洗脱除去大部分杂质。

在另一优选例中，步骤c后还包括步骤c’：超滤换液，添加稳定剂，然后灌装、冷冻干燥得成品。

在另一优选例中，缓冲液IV或V中含0-1M尿素。