[发明专利]一种新型烟叶发酵酶制剂生产方法

说明书

技术领域

烟叶自然发酵。

背景技术

在烟叶调制过程中，对经初烤和复烤后的烟叶在合适的温度和湿度条件下进行充分的发酵是提高和改善烟叶品质极为重要的技术环节。因此，对发酵机理的研究多年来一直是国内外相关学者和卷烟生产商们关注的焦点。其中一个重要研究领域就是烟叶发酵的酶机理的阐释和应用。早在1950年(Frankenburg，W.G)就有学者提出了烟叶发酵由酶催化的理论框架。随着研究的深入和积累，现在普遍认为烟叶本身所含的氧化还原酶类主导发酵作用，而且这种发酵过程是多种酶联合作用的结果，从而促使底物向多种香气物质成分的有效转化。这些酶促反应过程主要包括以下几个方面：1、萜烯类化合物降解过程。类胡萝卜素是烟叶中最重要的一类萜烯化合物，其是50多种烟叶特有香气成分的前体；2、Mailard反应。该反应过程是还原糖和氨基酸经分子重排后生成56种杂环化合物一类黑素，类黑素的形成使烟叶表现陈烟香气。尽管Mailard反应本身不是由酶催化的反应，但其底物一还原糖和氨基酸是酶促反应的产物。蛋白质在蛋白酶的作用下水解成氨基酸，淀粉和糖在水解酶的作用下水解生成葡萄糖、果糖等还原糖。因此，促进多糖和蛋白质的转化将有利于Mailard反应的进行；3、叶绿素的降解反应。烟叶中残存的叶绿素是卷烟制品在吸食过程中产生青杂气的根源，应在调制过程中加以控制。尽管烟叶叶绿素绝大部分已经在烟叶烘烤过程中被降解，但残存的叶绿素仍然会对卷烟制品带来不良影响；4、游离烟碱降解，消除强烈刺激性和不良余味；5、酰胺与易分解氨氮化合物的脱氨挥发作用。烟叶氨氮化合物在发酵过程中脱去氨基生成有机酸和氨气，有机酸积累与氨气自然挥发可提高发酵效果。这五个方面是烟叶发酵过程中主要的酶促反应过程，其它还包括一些小分子物质的缓慢物理挥发过程及次要的烟叶内含物转化反应。然而，烟叶在烘烤过程中的干燥脱水使烟叶内酶群绝大部分失活，因此不利于上述酶促反应的进行。基于这些认识，在烟叶发酵过程中添加专一性酶系或复合酶种促进烟叶发酵、加速烟叶内含物转化已经成为增加烟叶香气、加速发酵过程的一条途径。

张立昌报道了一种适合在打叶复烤时添加的酶制剂，对自然醇化和人工发酵烟叶的质量有明显的改善作用。该酶制剂可明显增加卷烟香气，减轻青杂气和刺激性，改善卷烟吸味品质。赵铭钦等利用4种具有生物活性的α-淀粉酶、蛋白酶等配制而成的烟草发酵增质剂进行烟叶发酵，试验表明烟叶香气质改善、香气量增加、烟叶固有杂气和刺激性减轻，烟叶内部的糖、氮、碱等主要化学成分及其比值趋于协调、平衡。在这些研究过程中所用的酶主要为糖化酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶。

阮祥稳等申请的中国专利CN200510042773.7公开了一种由多种外源生物酶(纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶)及酵母粉组成的复合酶制剂，其特征在于多种生物酶及酵母粉按照特定的比例直接进行组配。专利CN03114578.7公开了由纤维素酶、蛋白酶、转化酶、麦芽糖酶、溶菌酶组成的酶制剂。专利CN87101362.2公开了由纤维素酶、果胶酶、木质酶及蛋白酶的多种酶系的微生物复合酶。

以上文献和专利的一个共同特征是直接采用外源(微)生物酶经特定比例混合后直接进行手工操作施用，对如何保护酶活性及如何满足卷烟企业批量生产的要求没有进行描述。

发明内容

本发明提出一种烟叶发酵酶制剂的制备及生产工艺。该酶制剂的复合酶群来自于新鲜烟叶，经组织匀浆、酶群纯化、辅基置换分子修饰及蔗糖低聚物保护后得到由葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝卜素氧化酶、蛋白酶及烟碱降解酶五类酶组成的复合酶制剂。具体生产工艺如下(图1)：

1、取鲜活烟叶或顶权破碎细胞，测其体积，加缓冲液A(体积比V_汁液∶V_缓冲液＝1∶9)；

2、于4℃，2600g离心20min，取上清液并测体积，缓慢加入(NH₄)₂SO₄(144g/L)

至含25％(NH₄)₂SO₄(W/V)；

3、4℃缓慢混合30min，4℃ 15000g离心40min：

4、取上清液并测体积，加入(NH₄)₂SO₄(390g/L)至含80％(NH₄)₂SO₄(W/V)；